桂西地区幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的调查
【摘要】目的：了解桂西地区幽门螺杆菌(HP)对克拉霉素的耐药情况。方法：对2006年6月～2007年12月行胃镜检查，并经尿素酶试验初步确认HP感染的患者，取其胃黏膜标本进行微需氧培养，经生化、涂片检查鉴定为典型的HP，经转代选择其中生长发育良好的菌株126株，应用K-B法药敏试验测定其对克拉霉素的敏感性。结果：126株HP菌株中，对克拉霉素耐药的有28株，耐药率为22.2%(28/126)。结论：桂西地区HP菌株对克拉霉素耐药率略高，有必要定期检测或调查HP对抗生素的敏感性，以监测治疗的效果，提高根除HP的疗效。
【关键词】幽门螺杆菌；耐药性；克拉霉素；桂西
文章编号：1009-5519(2008)20-3029-02 中图分类号：R9 文献标识码：A
在幽门螺杆菌(HP)感染的治疗中，2003年10月的桐城共识会议推荐的HP根除的一线治疗方案是质子泵抑制剂/雷尼替丁/枸橼酸铋+两种抗生素，其中抗生素主要包括克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、四环素及呋喃唑酮，而质子泵抑制剂/枸橼酸秘+克拉霉素十阿莫西林的方案被推荐为首选的治疗方案。现在应用的一线方案中，各种不同的质子泵抑制剂在根除HP的有效率方面差异无显著性。因此目前对方案选择的争论多数集中在抗生素选择问题上。而抗生素的耐药性问题是目前影响治疗效果的主要原因。尤其对克拉霉素和甲硝唑耐药率的逐年增加，导致同样的治疗方案随着时间的推移，其HP根除率越来越低，很难达到理想的根除效果。因此HP耐药菌株的研究己引起人们的普遍关注。抗生素耐药菌株的出现是HP根治失败的主要原因，我们通过调查桂西地区HP对克拉霉素的耐药性不仅可以了解HP耐药状况，而且可以指导临床用药，克服耐药菌株的产生，提高根治率。
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1 材料
1.1 菌株：HP临床株分离来自右江民族医学院附属医院胃镜室，选取2006年6月～2007年12月病理诊断为胃溃疡、胃炎的患者胃黏膜，培养后经尿素酶、过氧化氢酶和HP快速诊断实验均为阳性的HP株。
1.2 培养基：哥伦比亚血琼脂培养基、脑心浸液培养基、螺杆菌添加剂购自广州迪景微生物科技有限公司；酪蛋白绵羊血由实验室自制。
1.3 微需氧袋：含5%氧的小型厌氧产气袋、厌氧塑料袋、厌氧塑料袋封口夹、厌氧指示剂购自广州迪景微生物科技有限公司。
1.4 生化试剂：1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、1%α-萘酚-乙醇溶液、3%过氧化氢溶液、幽门螺杆菌快速尿素酶试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.5 药敏纸片：克拉霉素15 μg/片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。
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2 方法
2.1 HP采集和培养：把采集的胃黏膜先进行HP快速尿素酶试验，阳性者则收集保存于脑心浸液培养基中，把培养基置保温瓶中冷冻送回实验室。在无菌工作台上把采集的胃黏膜和脑心浸液倒置在配制好的哥伦比亚血琼脂培养基中，使用手术剪刀快速把黏膜组织剪碎成5~6小块，然后使用L棒在哥伦比亚血琼脂培养基表面涂布均匀， 迅速放入厌氧塑料袋，剪开小型厌氧产气袋，放入厌氧指示剂，最后使用厌氧塑料袋封口夹封闭厌氧塑料袋，放置35 ℃培养。
2.2 直接涂片染色检查：按文献[1]进行革兰染色法染色。
2.3 生化鉴定
2.3.1 氧化酶试验：取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液1滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色，阴性于2分钟内不变色。
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2.3.2 触酶试验：挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
2.3.3 快速尿素酶试验：使用幽门螺杆菌试纸法，捏住试纸右端边缘，揭开不干胶至虚线处，(白色衬纸可以保留或不保留)。用接种环或无菌牙签调取菌落放在黄色试纸中央，然后将不干胶复合在胶片上，使不干胶与胶片紧密结合，1~3分钟内观察颜色变化，菌落边缘1分钟内有黄色变成紫红色为强阳性，3分钟变成紫红色为弱阳性，不变色为阴性。
2.4 药敏试验(K-B法)
2.4.1 按每1 000 ml蒸馏水称取哥伦比亚血琼脂培养基38 g配备血琼脂平板，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
2.4.2 将孵育4天的HP接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×107 CFU/ml)。
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2.4.3 用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在哥伦比亚血琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
2.4.4 平板在室温下干燥3～5分钟后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面，放入微需氧袋，置35 ℃孵育3~4天后测量抑菌环大小。记录抑菌圈的直径。判断标准参照第三军医大学检验系教研室，即抑菌环直径>7～10 mm为敏感，<7 mm为耐药。
3 结果
3.1 采集标本数量：总共采集了247例患者的胃黏膜，能成功培养出细菌，并经氧化酶实验、过氧化氢酶实验、快速尿素酶实验均为阳性和革兰染色为革兰阴性菌即诊断为HP的有126例。
3.2 耐药性试验结果：培养出来126株helicobacter pylori中有28株经K-B法药物敏感试验显示抑菌环直径为0 mm，表明是克拉霉素耐药菌株，耐药率是22.2%(28/126)。
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4 讨论
HP的耐药率在不同国家或地区不尽相同。各地报道的对克拉霉素的耐药率有很大差异[2~4]。HP耐药尤其是硝基咪唑类的耐药非常普遍，发达国家、欧美国家的耐药率要比发展中国家、亚洲国家低。耐药率也是在不断发展的。克拉霉素在人群中的广泛使用是导致耐药率增加的主要原因[5]。HP对抗生素的耐药有逐年增加的趋势，克拉霉素的耐药在不断发展。在日本[6]，HP对克拉霉素的耐药率由7%增加到15.2%，对克拉霉素的获得性耐药，在二联治疗方案根除后，可达90.9%，三联方案治疗后达到35.7%。我国上海地区自1995~1999年HP菌株对克拉霉素的耐药率从0%升至10% [7]。成虹等对北京地区HP耐药的发生率研究发现，克拉霉素的耐药率也达到13%[8]。可见HP对克拉霉素的耐药率正呈世界范围上升趋势。
本研究显示桂西地区患者分离HP对克拉霉素耐药率为22.2%(28/126)，略高于北京、上海报道的耐药率，原因是这几年来随着克拉霉素在本地区的广泛使用，敏感细菌被逐渐消灭，耐药菌留下来并进行繁殖，数量上由劣势变成了优势。另一个原因是耐药遗传信息的传递产生新的耐药株：控制耐药性的遗传信息存在于染色体DNA或质粒基因上，由于细菌DNA重组，使耐药基因进入敏感菌株，而使敏感株变成耐药株。
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研究中还发现有HP菌株对多种抗生素耐药(耐阿莫西林、甲硝唑、庆大霉素、链霉素)等，因此建议建立地区HP耐药性检测，根据耐药性选择敏感药物治疗，提高HP治愈率，并加强HP感染耐药机制的研究。
参考文献：
[1] 赵丽娟，黄衍强.医学微生物学实验指导与考试指南[M].南宁：广西科学技术出版社，2008.10.
[2] Poon SK，Chang CS，Su I，et al.Primary resistance to antibiotics and its clinical impact on the efficacy of Helicobaeter Pytori lansopraz-ole-based triple therapies[J].Aliment Pharm acol Ther，2002，16:291.
, 百拇医药 [3] Boyanova L，Mentis A，Gubina M，et al. The status of antimicrobial resistance of Helicobaeter Pytori in eastern Europe[J].Clin Microbiol Infect，2002，8:388.
[4] Kwon DH，Fouad AK，El-Zaatari，et al.Analysis of rdxA and Invole-ment of Additional Genes Encoding NAD(P)H Flavin Oxidoreductase(frxA) and Ferredoxin-Like Protein(FdxB) in MetronidazoleResis-tance of Helicobaeter Pytori[J]. AntimicrobialAgentsChemother，2000，44:2133.
[5] Taneike I，Goshi S，Tamura Y，et al.Emergence of clarithromyclin re-sistant to Helicobaeter Pytori (CRHP)with a high Prevalence in chil-dren compared with their parents[J].Helicobaeter，2002，7:297.
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[6] Perez Aldana L，kato M，Nakagawa S，et al.The relationship between consumption of antimicrobial agents and the Prevalence of Primary Helicobaeter Pytori resistance[J].Helicobaeter，2002，7:306.
[7] 史 彤，刘文忠，萧树东，等.上海地区幽门螺杆菌对抗生素耐药率的变迁[J].中华内科杂志，2000，39(8)：576.
[8] 成 虹，胡伏莲，王蔚虹.108株幽门螺杆菌(HP)菌株的耐药分析及其对HP根除的影响[J].中国临床药理学杂志，2001，17(74):415.
收稿日期：2008-05-19
, 百拇医药(黄衍强 黄赞松 何勇强 赵丽娟 周喜汉)
【关键词】幽门螺杆菌；耐药性；克拉霉素；桂西
文章编号：1009-5519(2008)20-3029-02 中图分类号：R9 文献标识码：A
在幽门螺杆菌(HP)感染的治疗中，2003年10月的桐城共识会议推荐的HP根除的一线治疗方案是质子泵抑制剂/雷尼替丁/枸橼酸铋+两种抗生素，其中抗生素主要包括克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、四环素及呋喃唑酮，而质子泵抑制剂/枸橼酸秘+克拉霉素十阿莫西林的方案被推荐为首选的治疗方案。现在应用的一线方案中，各种不同的质子泵抑制剂在根除HP的有效率方面差异无显著性。因此目前对方案选择的争论多数集中在抗生素选择问题上。而抗生素的耐药性问题是目前影响治疗效果的主要原因。尤其对克拉霉素和甲硝唑耐药率的逐年增加，导致同样的治疗方案随着时间的推移，其HP根除率越来越低，很难达到理想的根除效果。因此HP耐药菌株的研究己引起人们的普遍关注。抗生素耐药菌株的出现是HP根治失败的主要原因，我们通过调查桂西地区HP对克拉霉素的耐药性不仅可以了解HP耐药状况，而且可以指导临床用药，克服耐药菌株的产生，提高根治率。
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1 材料
1.1 菌株：HP临床株分离来自右江民族医学院附属医院胃镜室，选取2006年6月～2007年12月病理诊断为胃溃疡、胃炎的患者胃黏膜，培养后经尿素酶、过氧化氢酶和HP快速诊断实验均为阳性的HP株。
1.2 培养基：哥伦比亚血琼脂培养基、脑心浸液培养基、螺杆菌添加剂购自广州迪景微生物科技有限公司；酪蛋白绵羊血由实验室自制。
1.3 微需氧袋：含5%氧的小型厌氧产气袋、厌氧塑料袋、厌氧塑料袋封口夹、厌氧指示剂购自广州迪景微生物科技有限公司。
1.4 生化试剂：1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、1%α-萘酚-乙醇溶液、3%过氧化氢溶液、幽门螺杆菌快速尿素酶试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.5 药敏纸片：克拉霉素15 μg/片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。
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2 方法
2.1 HP采集和培养：把采集的胃黏膜先进行HP快速尿素酶试验，阳性者则收集保存于脑心浸液培养基中，把培养基置保温瓶中冷冻送回实验室。在无菌工作台上把采集的胃黏膜和脑心浸液倒置在配制好的哥伦比亚血琼脂培养基中，使用手术剪刀快速把黏膜组织剪碎成5~6小块，然后使用L棒在哥伦比亚血琼脂培养基表面涂布均匀， 迅速放入厌氧塑料袋，剪开小型厌氧产气袋，放入厌氧指示剂，最后使用厌氧塑料袋封口夹封闭厌氧塑料袋，放置35 ℃培养。
2.2 直接涂片染色检查：按文献[1]进行革兰染色法染色。
2.3 生化鉴定
2.3.1 氧化酶试验：取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液1滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色，阴性于2分钟内不变色。
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2.3.2 触酶试验：挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
2.3.3 快速尿素酶试验：使用幽门螺杆菌试纸法，捏住试纸右端边缘，揭开不干胶至虚线处，(白色衬纸可以保留或不保留)。用接种环或无菌牙签调取菌落放在黄色试纸中央，然后将不干胶复合在胶片上，使不干胶与胶片紧密结合，1~3分钟内观察颜色变化，菌落边缘1分钟内有黄色变成紫红色为强阳性，3分钟变成紫红色为弱阳性，不变色为阴性。
2.4 药敏试验(K-B法)
2.4.1 按每1 000 ml蒸馏水称取哥伦比亚血琼脂培养基38 g配备血琼脂平板，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
2.4.2 将孵育4天的HP接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×107 CFU/ml)。
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2.4.3 用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在哥伦比亚血琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
2.4.4 平板在室温下干燥3～5分钟后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面，放入微需氧袋，置35 ℃孵育3~4天后测量抑菌环大小。记录抑菌圈的直径。判断标准参照第三军医大学检验系教研室，即抑菌环直径>7～10 mm为敏感，<7 mm为耐药。
3 结果
3.1 采集标本数量：总共采集了247例患者的胃黏膜，能成功培养出细菌，并经氧化酶实验、过氧化氢酶实验、快速尿素酶实验均为阳性和革兰染色为革兰阴性菌即诊断为HP的有126例。
3.2 耐药性试验结果：培养出来126株helicobacter pylori中有28株经K-B法药物敏感试验显示抑菌环直径为0 mm，表明是克拉霉素耐药菌株，耐药率是22.2%(28/126)。
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4 讨论
HP的耐药率在不同国家或地区不尽相同。各地报道的对克拉霉素的耐药率有很大差异[2~4]。HP耐药尤其是硝基咪唑类的耐药非常普遍，发达国家、欧美国家的耐药率要比发展中国家、亚洲国家低。耐药率也是在不断发展的。克拉霉素在人群中的广泛使用是导致耐药率增加的主要原因[5]。HP对抗生素的耐药有逐年增加的趋势，克拉霉素的耐药在不断发展。在日本[6]，HP对克拉霉素的耐药率由7%增加到15.2%，对克拉霉素的获得性耐药，在二联治疗方案根除后，可达90.9%，三联方案治疗后达到35.7%。我国上海地区自1995~1999年HP菌株对克拉霉素的耐药率从0%升至10% [7]。成虹等对北京地区HP耐药的发生率研究发现，克拉霉素的耐药率也达到13%[8]。可见HP对克拉霉素的耐药率正呈世界范围上升趋势。
本研究显示桂西地区患者分离HP对克拉霉素耐药率为22.2%(28/126)，略高于北京、上海报道的耐药率，原因是这几年来随着克拉霉素在本地区的广泛使用，敏感细菌被逐渐消灭，耐药菌留下来并进行繁殖，数量上由劣势变成了优势。另一个原因是耐药遗传信息的传递产生新的耐药株：控制耐药性的遗传信息存在于染色体DNA或质粒基因上，由于细菌DNA重组，使耐药基因进入敏感菌株，而使敏感株变成耐药株。
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研究中还发现有HP菌株对多种抗生素耐药(耐阿莫西林、甲硝唑、庆大霉素、链霉素)等，因此建议建立地区HP耐药性检测，根据耐药性选择敏感药物治疗，提高HP治愈率，并加强HP感染耐药机制的研究。
参考文献：
[1] 赵丽娟，黄衍强.医学微生物学实验指导与考试指南[M].南宁：广西科学技术出版社，2008.10.
[2] Poon SK，Chang CS，Su I，et al.Primary resistance to antibiotics and its clinical impact on the efficacy of Helicobaeter Pytori lansopraz-ole-based triple therapies[J].Aliment Pharm acol Ther，2002，16:291.
, 百拇医药 [3] Boyanova L，Mentis A，Gubina M，et al. The status of antimicrobial resistance of Helicobaeter Pytori in eastern Europe[J].Clin Microbiol Infect，2002，8:388.
[4] Kwon DH，Fouad AK，El-Zaatari，et al.Analysis of rdxA and Invole-ment of Additional Genes Encoding NAD(P)H Flavin Oxidoreductase(frxA) and Ferredoxin-Like Protein(FdxB) in MetronidazoleResis-tance of Helicobaeter Pytori[J]. AntimicrobialAgentsChemother，2000，44:2133.
[5] Taneike I，Goshi S，Tamura Y，et al.Emergence of clarithromyclin re-sistant to Helicobaeter Pytori (CRHP)with a high Prevalence in chil-dren compared with their parents[J].Helicobaeter，2002，7:297.
, http://www.100md.com
[6] Perez Aldana L，kato M，Nakagawa S，et al.The relationship between consumption of antimicrobial agents and the Prevalence of Primary Helicobaeter Pytori resistance[J].Helicobaeter，2002，7:306.
[7] 史 彤，刘文忠，萧树东，等.上海地区幽门螺杆菌对抗生素耐药率的变迁[J].中华内科杂志，2000，39(8)：576.
[8] 成 虹，胡伏莲，王蔚虹.108株幽门螺杆菌(HP)菌株的耐药分析及其对HP根除的影响[J].中国临床药理学杂志，2001，17(74):415.
收稿日期：2008-05-19
, 百拇医药(黄衍强 黄赞松 何勇强 赵丽娟 周喜汉)