骨缺损修复过程中TGF-β2基因的PCR定量动态分析
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【摘要】目的：探讨骨缺损修复过程中转化生长因子(TGF-β2)基因的动态定量变化与时间的关系。方法：实验家兔30只，随机分成6组，取右桡骨用骨磨钻制成20 mm的骨缺损模型为实验组，取自体髂骨制成大小1~2 mm的颗粒状移植于右桡骨骨缺损处。术后3天、1、2、4、6、8周处死动物取材，进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)，具体观察和分析骨缺损修复过程中TGF-β2基因的动态定量变化与时间的关系。结果：实验组3天、1、2、4、6、8周时TGF-β2的相对表达量为0.57、1.00、1.40、1.44、1.59、1.27。结论：骨缺损修复过程中TGF-β2基因的动态定量变化与时间的关系，为骨折和骨缺损的治疗从分子生物学基因动态定量变化方面提供了科学理论依据。
【关键词】骨缺损；血管内皮生长因子；聚合酶链反应
文章编号：1009-5519(2008)22-3330-02 中图分类号：R6 文献标识码：A
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骨组织的愈合是骨折或骨缺损的修复过程，在组织上可概括为[1]组织修复期，原始骨痂形成期，成熟骨板期和塑形期，骨折的愈合有许多生长因子参与，其中转化生长因子(TGF-β2)在骨组织的生长和发育以及再生与修复等生理病理过程中起重要作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备：家兔30只，体重2.0~2.5 kg，雌雄不限，随机分成6组，每组每只家兔，取右挠骨在无菌状态下用骨磨钻制成20 mm的骨缺损模型为实验组，取髂骨制成大小1~2 mm的颗粒状移植于右桡骨骨缺损处。术后按0.1 g/kg头孢唑林钠连续肌肉注射4天，预防切口感染。于手术后3天、1、2、4、6、8周处死家兔，取骨缺损处的移植物标本迅速放入液态，取出后在研钵中研磨，用Trazol方法提取mRNA构建扩增，以备做定量聚合酶链反应(PCR)。
1.2 主要试剂：PCR相关试剂(大连宝生物公司提供)。
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1.3 方法：Real Time PCR法检测各目的基因相对表达量，使用从大连大学购买兔子的骨Total RNA做为管家基因(GAPDH)的RNA标准品。以体外转录构建的RNA作为目的基因(TGF-β2)的RNA标准品，将兔骨Total RNA (500 ng)反转录获得的cDNA用EASY Dilution按10倍梯度稀释(100、101、102、103、104倍，相当于100 ng~10 pg Total RNA添加量)作为模板，进行Real Time PCR反应，制作管家基因的标准曲线；将体外构建的TGF-β2目的基因RNA标准品(107 copies/ul)反转录获得的cDNA用EASY Dilution按10倍梯度稀释(100、101、102、103、104倍，作为模板。以提供的样品分别在管家基因、目的基因标准曲线上定量，并进行相对表达量分析。
2 结果
PCR反应。TGF-β2目的基因在94 ℃ 30 s，55～65℃ 30 s，30 Cycles 72 ℃ 1 min/kbp的条件下3天是837拷贝，1周是675拷贝，2周是873.5拷贝，4周是266.5拷贝，6周是308.5拷贝，8周是380.5拷贝。以1周拷贝为基础，其他各周与其比值在3天、1、2、4、6、8周为0.57、1.00、1.40、1.44、1.59、1.27。植骨后4~6周时TGF-β基因表达量达高峰。见表1。
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3 讨论
骨缺损通常由外伤、感染、恶性肿瘤及人工关节翻修手术等所致。其修复特别是大段骨缺损的修复是骨科的一大棘手问题[2]。在骨折愈合及骨缺损修复过程中多种生长因子参与其过程，例如BMP、VGEF、TGF-β等，其中TGF-β起着重要的作用。TGF-β在骨和血小板中含量最为丰富。其作用机理是在骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和骨髓细胞通过自分泌和旁分泌途径均能产生TGF-β ，作为分泌型蛋白TGF-β是以一种潜在的活性形式——LTGF-β(latent TGF-β)结合本并贮存。骨折发生后，由于活化的破骨细胞产生低pH值的微环境，以及类似于纤维蛋白溶解酶的蛋白酶激活LTGF，从而使TGF-β释放出来，并开始发挥其生物学效应。有研究发现TGF-β作用于软骨细胞可使其生成Ⅱ型胶原的作用受到抑制，而对成骨细胞产生Ⅰ型胶原却有促进作用，可使成骨细胞产生Ⅰ型胶原的能力成倍增加，因而缩短了骨缺损修复的软骨期，使骨缺损修复时间缩短。本实验以家兔桡骨骨折模型模拟正常骨缺损，用自体髂骨骨松质制成颗粒状植骨修复长段骨缺损。并用Real Time PCR的方法观察了骨缺损的修复时间与TGF-β的定量动态表达关系。结果表明：实验组3天、1、2、4、6、8周时TGF-β的相对表达量为0.57、1.00、1.40、1.44、1.59、1.27。4~6周时TGF-β基因表达量达高峰。传统骨缺损治疗实验研究是用HE染色、免疫组织化学、原位杂交、电镜观察、PCR的实验方法来确定与骨生长有关生长因子的半定量分析。本实验用动态定量变化PCR的方法从具体拷贝数上测定了转化生长因子在骨缺损修复过程中与时间变化关系，为骨折和骨缺损的治疗从分子生物学基因方面提供了科学理论依据。当然，骨缺损的修复是一个复杂的生物学过程，成骨是多种因素共同作用的结果，本研究仅探讨用自体髂骨骨松质制成颗粒状植骨修复骨缺损的机制，而实际准确地揭示这一机理需要在分子生物学方面进一步研究和探讨。
参考文献：
[1] 曹建中，胡广州，张大勇，等.骨内科及骨外科诊断治疗学[M].北京：中国科学技术出版社，2003.20.
[2] 李志跃，孙运才.骨基质明胶复合红骨髓及同种骨修复节段性骨缺损的实验研究[J].中华骨科杂志，2000，7：440.
收稿日期：2008-06-19 修回日期：2008-07-10, 百拇医药(李成福 杨玉宝 金元哲)