荧光载体的构建及其鉴定
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【摘要】目的：构建增强型绿色荧光蛋白的pET-32a-EGFP原核表达载体。方法：用基因克隆的方法构建pET-32a-c(+)-EGFP重组表达质粒，经IPTG诱导表达后，观察荧光，用亲和层析的方法纯化His-EGFP融合蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定其分子量。结果：测序证实pET-32a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致，荧光显微镜下观察到大肠埃希菌DE3中强烈荧光。结论：成功构建了能在体内稳定表达的pET-32a-EGFP载体，为进一步研究药物的作用机制打下了良好的基础。
【关键词】增强型绿色荧光蛋白；pET-32a-c(+)载体；重组载体
【中图分类号】R282.6 【文献标识码】B 【文章编号】1009-6019(2008)-03-0042-2
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是一类存在于水母、水螅和珊瑚虫等腔肠动物体内的生物发光蛋白，1974年由Morise等从发绿色荧光的水母中提纯出来[1]。GFP当受到紫外或蓝光激发时能发绿色荧光，且荧光性质稳定，无种属限制。目前应用较多的是经突变改造，即增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)，它更适合在大肠杆菌中高效表达[2]。本文将EGFP作为报告基因，将其连接到pET-32a-c(+)载体上，为我们的后续试验奠定良好基础。
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1材料与方法
1.1主要试剂、菌株及质粒
限制性内切酶(NcoⅠ和BamHⅠ)、T4DNA连接酶、TagPCR多聚酶均购自Takara公司。宿主菌DE3及原核表达质粒pET-32a-c(+)均为本室保存。
1.2方法
1.2.1EGFP基因的PCR扩增
根据EGFP的编码序列，涉及一对引物，在上游引物EGFP-P1引入限制性内切酶位点NcoⅠ(5’-CACCATGGTGAGCAAG-3’)，在下游引物EGFP-P2引入限制性内切酶位点BamHⅠ(5’-GCGGATCCCTTGTACAGCTCGTC-3’)。以pEGFP-N1为模板，95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环，最后72℃7min。1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
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1.2.2pET-32a-EGFP重组质粒的构建
扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，然后按常规方法连接于经同样双酶切的原核表达质粒pET-32a-c(+)载体。将连接产物转化入大肠杆菌DE3，挑取阳性菌落入LB培养基摇菌，提取质粒，行PCR(所用引物及反应条件均同第一步)酶切电泳及基因测序鉴定。
1.2.3重组融合EGFP蛋白的分离纯化及鉴定
IPTG诱导大肠杆菌DE3的蛋白表达，-70℃反复冻融10次后，破菌，收上清，经HisTrapKit柱纯化，SDS-PAGE鉴定。
1.2.4荧光检测
取诱导表达的含pET-32a-EGFP的DE3大肠杆菌菌液1ml，12000r/min离心2min，沉淀用1ml的生理盐水洗涤2遍，再用1ml的生理盐水重悬后荧光显微镜下观察。
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2结果
2.1聚合酶链反应(PCR)扩增EGFP片段
以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增，经1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出700bp的特异性EGFP片段，见图1：
2.2pET-32a-EGFP载体的鉴定
pET28a2EGFP载体经双酶切和测序鉴定，结果显示EGFP序列成功插入了pET-32a-c(+)载体，插入的EGFP序列与GenBank中序列完全一致。
2.3重组质粒pET-32a-EGFP的原核表达
将经IPTG诱导表达的蛋白用HisTrapKit亲和层析柱纯化后行SDS-PAGE电泳，可见在约53KD处有明显的较为单一的条带，蛋白分子量大小与已有的文献报道相符。如图2所示：
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2.4荧光观察
重组质粒pET-32a-EGFP转化感受态大肠埃希菌DE3经IPTG诱导3h后，PBS1∶1000稀释，37℃干燥后，荧光显微镜观察到菌体内有明亮绿色荧光。
3讨论
1974年由Morise等从发绿色荧光的水母中提纯出来GFP[1]。GFP当受到紫外或蓝光激发时能发绿色荧光，且荧光性质稳定，无种属限制。1994年Chalfie等首次在大肠杆菌中表达了能发绿色荧光的GFP[3]，此后绿色荧光蛋白基因作为一种新的报告基因受到了人们的极大关注。目前应用较多的是经突变改造，即增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)。EGFP作为一种新型的报告基因，无须试剂检测，能催化自身形成发色结构，并在蓝光激发下发出绿色荧光，其直观、明亮。现普遍认为，EGFP不影响靶蛋白的功能。
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外源蛋白在大肠埃希菌中大量表达时，易形成不溶性的包涵体，需要一个繁琐复性过程，才能获得有活性的靶蛋白，有时复性后的蛋白活性会降低。我们运用自己设计的引物成功构建了能在大肠埃希菌中高水平表达可溶性天然型活性EGFP蛋白的pET-32a-EGFP载体，为进一步研究提供了可靠的报告分子。
本实验利用原核表达质粒pET-32a-c(+)成功地构建、表达出融合蛋白His-EGFP。pET-32a-c(+)是T7启动子控制下的高效融合表达载体，由于其存在独特的硫氧还原蛋白编码基因，能增加此融合蛋白在E.coli细胞浆中的可溶性。为方便蛋白的纯化，我们选用了带融合标签的pET-32a-c(+)载体。利用金属螯合亲和层析技术将His融合表达的目的产物纯化。该法方便、快速，而且得到的蛋白纯度高，有利于下一步实验的进行。
参考文献:
[1]CaseyJL，ColeyAM，TilleyLM，etal.Greenfluorescentantibodies：novelinvitrotools[J].ProteinEng，2000，13(6)：445-452
[2]StauberRH，HorieK，CarneyP，etal.Developmentandapplicationsofenhancedgreenfluorescentproteinmutants[J].Biotechniques，1998，24(3)：462-466
[3]CHALFIEM，TUY，EUSKIRCHENG，etal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression[J].Science，1994，263：802-805, 百拇医药(陈军利 王 薇 聂双发)