于平 吴赟婷 杨柳贞 贺 敏 胡淳玉 刘 航 易明花

    (浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州 310035)

    中性蛋白酶是一类能够在中性和弱酸或弱碱性环境中催化蛋白质水解产生游离氨基酸和多肽片段的酶的总称[1]，其作用最适pH值在6.0～7.5之间，分子质量为35 000～40 000 u，等电点为8.0～9.0[2]。中性蛋白酶是人类最早应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一[3]，由于其作用条件温和，催化速率高[4]，在食品工业[5-7]、医药工业[8-10]、纺织业[11-13]、饲料工业[14-15]、化妆品行业[16-17]、洗涤行业[18-19]和废弃物处理[20]中得到广泛应用。

    综合近十年国内外对中性蛋白酶的研究报道，可以看出我国对中性蛋白酶的研究仍处于初级水平，目前所研究的中性蛋白酶大多由陆生微生物发酵生产，对其研究仍主要集中在高产菌株的选育和发酵条件的优化上[21-22]，如孙春华等[23]研究经紫外诱变和培养条件优化，使米曲霉产中性蛋白酶的活力比优化前提高了1.29倍。马宏颖等[24]以枯草芽孢杆菌N19为出发菌株，利用物理和化学复合诱变的方法，使中性蛋白酶的酶活力提高了1.72倍。国外对中性蛋白酶的研究主要集中在分离纯化和性质方面[25-26]，如Ruf等[27]研究了抑制剂对细菌胞外蛋白酶的影响，Hamin等[28]研究了嗜热菌产生的中性蛋白酶的特异性和生化特性等。

    在前期研究中，课题组从土壤中筛选了一株能够产新型中性蛋白酶的蜡样芽孢杆菌，该菌株所产的中性蛋白酶具有良好的耐热性，应用前景广阔。本文主要通过Plackett-Burman试验设计和响应面分析法对所筛选的蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶的发酵条件进行优化，旨在进一步提高该菌株产中性蛋白酶的活力，从而为其产业化生产和应用奠定良好基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    蜡样芽孢杆菌：由课题组成员从土壤中经过反复初筛和复筛分离得到。该菌株能够产耐热性新型中性蛋白酶。经生理生化和分子生物学鉴定后，确定该菌株为蜡样芽胞杆菌。

    葡萄糖、蛋白胨、酪蛋白、Tween-80、氯化钠、硫酸镁、盐酸和氢氧化钠等，国药化学试剂公司；Folin-酚试剂、三氯醋酸等，上海生工生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯级。

    1.2 仪器与设备

    立式全自动高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司；SKY-200B恒温摇床，上海苏坤实业有限公司；2K15型高速低温冷冻离心机，德国Sigma公司；CHB-100恒温水槽 ......