田 阳 饶 欢 薛文通

    (中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083)

    花生过敏是一种发病率高且难以治愈的过敏性疾病，严重时可引发皮炎、哮喘、呼吸困难乃至死亡。 据统计，世界范围内高达1%的儿童对花生过敏[1-2]。花生过敏在美国、加拿大、英国、以色列的儿童发病率分别达到了1.4%，1.7%，1.9%和0.2%。引发花生过敏的蛋白有17 种[4]， 其中含量最高(15%)的是Ara h 1[5]，研究显示超过95%的中国患者血清可识别该蛋白[6]。 Ara h 1 是同源三聚体，由3 条分子质量均为63.5 ku 的肽链组成[7]。23个致敏表位分布在肽链交联处，使其在热加工、酶解乃至消化过程中仍能保持免疫活性[8]。 研究Ara h 1 的结构及特性，对明确花生致敏机理，生产低致敏花生制品具有重要意义。

    如何实现Ara h 1 的有效提取及纯化， 是后续研究的第1 步。 目前较为成熟的提纯方法一般包括硫酸铵盐沉淀、阴离子交换层析、凝胶排阻层析、亲和色谱柱层析等流程[9-10]，持续时间较长，步骤繁琐，且成本较高。 Ara h 1 在冗长的提纯过程中容易降解或失活， 层析的过多更会降低目标蛋白的得率。 蛋白的重组表达可有效避免操作流程的繁琐，提高纯度与得率，降低纯化成本。 重组蛋白的基因序列与天然蛋白一致，在结构、功能特性方面与天然蛋白差异较小[11]。 此外，使用重组技术生产的低致敏性蛋白被应用于口服免疫治疗实验中[12]，取得了良好的治疗效果。 重组致敏蛋白在研究致敏原结构表征[13]、致敏原检测[14]、致敏机理以及抗敏疫苗[15]的开发等方面正在被愈加广泛的应用。

    现有研究表明， 重组Ara h 1(recombinant Ara h 1， rAra h 1)的制备过程仍存在技术难题。 由于原核表达系统与植物源蛋白之间的遗传特性差异较大，所以rAra h 1 在大肠杆菌中的表达程度较低，且易形成包涵体，难以释放在裂解液上清中。蛋白在装配过程中较易错误折叠，形成低分子质量的变体，使得rAra h 1 的纯化变得较为困难。本研究针对以上问题，对基因工程菌诱导过程、菌体裂解条件、蛋白纯化流程进行优化，逐步建立高效的rAra h 1 制备方法，为进一步开展致敏原的结构及生物活性研究提供技术支持。

    1 材料和方法

    1.1 材料与试剂

    pET-32a(+)Ara h 1 重组质粒，由生工生物工程(上海)公司合成。大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pLysS 感受态细胞 ......