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编号:11052958
茶多酚对膀胱肿瘤细胞端粒酶活性的影响
http://www.100md.com 2005年12月1日 王 田 邱学德 黄 杰 刘乔保 肖民辉 杨晓华
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    参见附件(250KB，3页)。

     Effects of ()epigallocatechin gallate on telomerase activity of bladder neoplasma cells

    Wang Tian, Qiu Xuede, Huang Jie, Liu Qiaobao, Xiao Minhui, Yang Xiaohua

    (

    Department of Urology, The First Peoples Hospital of Yunnan Province, Kunming 650031, China)

    ABSTRACT: Objective To investigate the effects of ()epigallocatchin gallate (EGCG) on telomerase activity of bladder carcinoma cell line T24 and BIU87 and its possible mechanisms. Methods The experimental groups were treated with EGCG and the control groups with adriamycin. The inhibitory rate of cell proliferation, and the rate of cell apoptosis were determined by MTT, flow cytometer, respectively. The inhibitory rate of telomerase activity of the cells were determined by PCRELISA methods after the cells were treated with 1/4 IC50 EGCG and adriamycin after 24h, 48h and 72h. The expression quantity of hTERT and cmyc mRNA were determined by semiquantitative RTPCR after treated by 1/4 IC50 EGCG and adriamycin after 24h, 48h and 72h. Results Either

    EGCG or adriamycin showed timedependent and dosedependent cytotoxicity. The cell apoptosis could be induced by IC50 of EGCG and adriamycin. After the cells were treated with 1/4 IC50 EGCG and adriamycin, The telomerase activity of T24 cell line decreased by 67.8% and 34.1%, respectively, and that of BIU87 cell line decreased by 63.7% and 23.2%, respectively. The expression of hTERT and cmyc mRNA also decreased. Conclusion Our study

    suggests that the telomerase activity of bladder neoplasma cells can be restrained by EGCG. The application of EGCG as a telomerase activity inhibitor in cancer treatment needs further study.

    KEY WORDS: bladder neoplasma; ()epigallocatchin gallate; telomerase; hTERT/cmyc mRNA

    摘要：目的 探讨茶多酚(EGCG)对膀胱肿瘤细胞株T24和BIU87的端粒酶活性影响及其可能机制。方法 用MTT法测定治疗组(EGCG)、阳性对照组(阿霉素)、阴性对照组的细胞抑制率，用流式细胞仪测定细胞凋亡率。将1/4 IC50 的EGCG和阿霉素作用于肿瘤细胞株24h、48h和72h后，用PCRELISA法测定肿瘤细胞的端粒酶活性。用1/4 IC50的药物作用于肿瘤细胞株24h、48h和72h后， 用半定量RTPCR法测定人端粒酶逆转录酶(hTERT)和cmyc mRNA表达量。结果 EGCG和阿霉素均表现为剂量和时间依赖的细胞抑制作用。IC50浓度的EGCG和阿霉素均能够导致肿瘤细胞的凋亡。用1/4 IC50浓度的EGCG和阿霉素分别作用于细胞株72h后，T24细胞的端粒酶活性分别降低67.8%和34.1%，BIU87分别降低63.7%和23.2%。1/4 IC50浓度的EGCG作用于肿瘤细胞株后，其hTERT和cmyc mRNA表达量降低。结论 EGCG能够抑制膀胱肿瘤细胞株的端粒酶活性，作为端粒酶活性抑制剂，其用于肿瘤治疗的可能性还需进一步研究。

    关键词：膀胱肿瘤；茶多酚；端粒酶；hTERT/cmyc mRNA

    端粒酶是一种核蛋白酶,以自身所带RNA为模板在染色体末端添加重复的六核苷酸序列(TTAGGG)。文献报道，约82.9%～86.2%的膀胱肿瘤都表现为端粒酶活性增强\[1,2\]。端粒酶活性的增强使恶性肿瘤等细胞无限制地生长、分化，成为永生细胞。因此，端粒酶是治疗肿瘤的一个较为理想的靶点。体外实验和体内实验均证实茶多酚(epigallocatechin3gallate, EGCG)具有抑制端粒酶活性，诱导肿瘤细胞凋亡作用。为了明确EGCG对膀胱肿瘤的作用和EGCG对化疗药物的影响，我们观察了EGCG对膀胱肿瘤细胞株端粒酶的影响。

     1 材料与方法

    1.1 材料

    BIU87细胞株，购自北京大学医学院免疫学系；T24细胞株，购自上海细胞所细胞库。EGCG，Calbiochem公司；阿霉素，华北制药厂；Annexin VFitc，购自Immunotech公司；PCR ELISA端粒酶活性测定试剂盒，购自Roche公司。EPICS XL型流式细胞仪(美国)，∑950型酶标仪(美国)。

    1.2 方法

    1.2.1 MTT测定IC50

    EGCG按10、20、40、80、160、320μmol/L浓度配制；以阿霉素作为阳性对照，浓度按3.5、7、14、28、56、112μmol/L浓度配制。取对数生长期细胞依次加药，培养24h、48h和72h后，MTT法测定各培养孔在650nm和550nm双波长下吸光度值(A)， 用相应的统计学软件计算药物作用24h、48h和72h后的相关系数和IC50浓度。

    1.2.2 细胞凋亡测定

    取对数生长期细胞，按细胞浓度为2×105/mL种于24孔板。培养24h后加药，加药浓度为72h 的1/2×IC50、IC50 和2×IC50，培养24、48、72h后按试剂盒说明书操作测定凋亡率。

    1.2.3 端粒酶活性测定

    按照标准方法收集细胞，每个反应加2×105个细胞，并将细胞转移至一新的Eppendorf管内。在4℃冷冻离心机 3000×g下离心使细胞沉淀，小心去上清液，用PBS液重悬细胞，再次离心。重悬细胞内加入200μL 裂解液，置冰上30min，裂解产物在4℃ 16000×g下离心20min，转上清致一新管内。取25μL反应混合物至100μL的扩增管内，加入3μL细胞抽提液，加双蒸水至总反应体积为50μL。按引物延伸25℃ 20min，端粒酶变性94℃ 5min，扩增94℃ 30s，退火50℃ 30s，聚合72℃ 90s的程序循环30次。在450nm，参考波长为690nm下测定吸光度值。所有待测样品均采用1mg/mL的蛋白浓度。其余按试剂盒说明操作和计算端粒酶相对活性。

    1.2.4 EGCG对hTERT和cmyc mRNA表达量的影响

    采用1/4 IC50的EGCG和阿霉素作用于肿瘤细胞株24h、48h和72h后，用半定量RTPCR法测定人端粒酶逆转录酶(hTERT)和cmyc mRNA表达量。hTERT、cmyc和βactin 的引物序列如下：

    hTERT(145bp):

    5′CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA3′

    5′GGATGAAGCGGAGTCTGGA3′

    cmyc(505bp):

    5′GCACGACTCTATGTGCACCGG3′

    5′CTTGAGGACCAGTCGCCTGT3′

    βactin (309bp):

    5′AGCGGGAAATCGTGCGTG3′

    5′CAGGGTACATGGTGGTGCC3′

    1.2.5 结果分析

    用SSPS 11.1软件作相应的统计学分析。

     2 结 果

    2.1 IC50测定结果

    EGCG和阿霉素的IC50值如表1所示。可见随药物作用时间的延长，IC50的浓度逐渐降低。当药物浓度较接近1/4 IC50时，药物对肿瘤细胞株的抑制率较低。表1 EGCG和阿霉素对T24和BIU87细胞株的24h、48h和72h的IC50值(略)

    2.2 细胞凋亡测定结果

    以EGCG和阿霉素的72h 1/2×IC50、IC50 和2×IC50 三个浓度作用于细胞株后，凋亡率测定的结果见表2。当药物浓度为72h的1/4IC50时，用药组各时间段的细胞凋亡率与阴性对照组比较，无显著性差异(P<0.05)，即药物浓度为72h的1/4IC50时，EGCG和阿霉素几乎不能使肿瘤细胞凋亡。表2 EGCG和阿霉素作用于T24和BIU87细胞株后24h、48h和72h的平均细胞凋亡率(略)

    2.3 端粒酶活性测定结果

    将1/4 IC50浓度作用于细胞株后，两株肿瘤细胞的端粒酶活性的变化情况见表3。可见，虽然1/4 IC50浓度的EGCG对肿瘤细胞株的细胞毒作用较小，但是与阴性对照组的端粒酶活性比较该浓度作用于细胞株24h后端粒酶活性降低约34%，48h后降低50%，72h后降低68%(P<0.05)。而阿霉素作用后24h、48h和72h后对端粒酶活性的降低与阴性对照组比较无明显的差异(P>0.05)。由此可见，低于有明显细胞毒作用浓度的EGCG能够抑制膀胱肿瘤细胞株的端粒酶活性。表3 EGCG和阿霉素作用于T24和BIU87细胞株后24h、48h和72h的平均端粒酶相对活性(略)

    2.4 药物对细胞株hTERT和cmyc mRNA表达量的影响

    1/4IC50的EGCG和阿霉素对细胞株hTERT和cmyc mRNA表达量的影响见表4。结果提示：与阴性对照组比较，用EGCG组72h的1/4 IC50浓度作用于细胞株24h和48h后，hTERT和cmyc mRNA表达量降低，72h后降低更为明显(P<0.05)。阿霉素组则变化不明显(P>0.05)。表4 EGCG和阿霉素对hTERT和cmyc mRNA表达量的影响(略)

     3 讨论

    端粒酶是一个反转录酶，它能够以自身为模板合成端粒，使染色体两端的端粒不缩短，避免染色体两端融合，使细胞无限繁殖。肿瘤细胞端粒酶活性增强是肿瘤细胞永生化的原因之一\[3\]。文献报道82%～86%的膀胱肿瘤细胞端粒酶活性增强\[1,2\]，而正常组织细胞的端粒酶活性较低。因此，抑制膀胱肿瘤的端粒酶活性是膀胱肿瘤治疗的一个较为理想的靶点。

    EGCG为一绿茶提取物，是茶多酚的主要成分。研究证实，EGCG能够通过抑制肿瘤细胞DNA复制和干预细胞增殖有关的信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本研究结果提示，在EGCG剂量较大时，表现为剂量和时间依赖性地抑制膀胱肿瘤细胞株的生长，并诱导其凋亡。显然，EGCG的这种细胞毒作用是没有选择性的，不仅对肿瘤细胞有杀伤作用，而且还对正常组织细胞也有杀伤作用。因此选择性不高。当然，有一个问题就是膀胱肿瘤术后化疗大多数均可采用局部灌注来完成，不需要过多考虑全身性的毒副作用，可是，对于那些已经发生了全身转移的患者或需要预防全身转移的患者，就必须考虑全身性的毒副作用。可见，寻求全身性毒副作用较小或选择性较高的膀胱肿瘤化疗药物是有必要的。

    杨金亮等\[4\]报道EGCG对胃癌细胞的端粒酶活性有较强的抑制作用。Naasani等\[5\]体内外试验均证实EGCG能够直接地强烈抑制前列腺癌细胞的端粒酶活性。他们认为EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的主要机制是抑制肿瘤细胞的端粒酶活性。本研究结果提示EGCG对膀胱肿瘤的端粒酶活性具有抑制作用，而且低于细胞毒浓度的EGCG即可表现出对膀胱肿瘤细胞株的端粒酶活性抑制作用。这一结果为提高EGCG的选择性，降低全身性的不良反应提供了基础。

    目前，EGCG使肿瘤细胞的端粒酶活性下降的机制并不明确。文献报道hTERT是端粒酶的催化亚单位，与端粒酶的活性密切相关\[3\]。cmyc基因是与病毒癌基因同源的细胞癌基因，一般认为cmyc基因转录的蛋白具有调节细胞内其他基因的表达。文献报道cmyc基因蛋白能够激活端粒酶的活性\[6\]。本研究结果提示，EGCG能够降低hTERT和cmyc mRNA表达量，而阿霉素则无此作用。与文献报道的结果一致。hTERT和cmyc mRNA表达量降低可能与EGCG抑制端粒酶活性有关，但EGCG影响hTERT和cmyc mRNA表达量的具体机制则待进一步研究。

    总之，EGCG抑制端粒酶活性的浓度较其细胞毒作用的浓度低得多，它能够使肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低，从而可导致肿瘤细胞的端粒缩短，使肿瘤细胞逐渐凋亡。绿茶来源丰富，其抗肿瘤作用及其机制值得进一步研究。

     参考文献：

    \[1\]唐正严,易红,谌兵来,等. 膀胱癌组织中端粒酶活性测定 \[J\]. 湖南医科大学学报, 2001, 26(2):167-168.

    \[2\]柳建军,曹军,李普云,等. 膀胱癌组织中端粒酶活性的检测及其意义 \[J\]. 实用癌症杂志, 2001,16(3):228-230.

    \[3\]赵万洲，张洪杰，韩锐. 端粒酶活性调节与端粒酶抑制剂的研究\[J\]. 中华肿瘤杂志, 1999, 21(2):156-158.

    \[4\]杨金亮，殷殿春，杨仕明,等. 表没食子儿茶素没食子酸酯对胃癌细胞端粒酶活性的抑制作用 \[J\]. 第三军医大学学报, 2001, 23(8):931-933.

    \[5\]Naasani I, OhHashi F, OhHara T, et al. Blocking telomerase by dietary polyphenols is a major mechanism for limiting the growth of human cancer cells in vitro and in vivo \[J\]. Cancer Res, 2003,63(4):824-830.

    \[6\]Wu KJ, Grandori C, Amacker M, et al. Direct activation of TERT transcription by cmyc \[J\]. Nat Genet, 1999, 21(2):220-224.

    作者简介：王田(1964)，男，昆明市人，大学本科，副主任医师，从事泌尿外科工作.

    (云南省第一人民医院泌尿外科，云南昆明650031)

    (编辑 邱芬)

    收稿日期：20041128

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