基于ｖｖｈＡ基因ＴａｑＭａｎ实时荧光定量ＰＣＲ快速检测创伤弧菌的研究(1)
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[摘要]目的建立基于溶细胞毒素基因vvhA检测创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的TaqMan实时荧光定量PCR。方法 采用Primer Express软件，设计位于vvhA基因序列保守区的PCR引物和TaqMan探针，建立检测创伤弧菌vvhA基因100 bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR。采用基因克隆技术，构建作为阳性对照的pMD19-vvhAlOHD重组质粒。以最低扩增循环数(ct值)、荧光强度增加值(ARn)为观察指标，对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR条件进行优化。以不同浓度的创伤弧菌及其它8种细菌DNA和pMD19-vvhAl00为模板，对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性进行验证。创伤弧菌经腹腔和皮下注射及灌胃感染ICR小鼠，验证vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR对感染小鼠血液、皮下感染组织和肠内容物的检测效果。结果 所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或pMD19-vvhA100呈现阳性检测结果，其检测灵敏度可达0.01 ng创伤弧菌DNA或103个拷贝的pMD19-vvhA100，不同浓度pMD19-vvhA100三次检测结果的sD≤0.79，对腹腔和皮下感染创伤弧菌的小鼠血液、皮下组织标本检测结果均为阳性。结论所建立的创伤弧菌vvhA基囚TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点，适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。
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[关键词]创伤弧菌；vvhA基因；TaqMan探针；实时荧光定量PCR；检测
创伤弧菌(Vibrio uulnificus)是革兰阴性嗜盐弧菌，广泛存在于海产品中，尤以牡蛎中多见。创伤弧菌感染是新发传染病之一，Thorsteinsson等首先报道了3例创伤弧菌引起的人类原发性败血症，1979年Farmer等予以命名。日本、北美和中东地区以及中国浙江、广东、台湾等沿海地区常有创伤弧菌感染的病例报告。创伤弧菌感染以原发性败血症和创口感染最为常见，此外还可引起胃肠炎、肺炎、脑膜炎、角膜炎等。创口感染和原发性败血症发病急、进展快，若不及时采取针对性治疗措施，约50%创口感染患者须截肢以保全生命，50%-80%原发性败血症患者发病后数天内死亡。因此，创伤弧菌感染早期、快速诊断极为重要，但目前尚无相关临床实验室诊断方法及其产品。
实时荧光定量PCR具有快速、特异和敏感等优点，尤其适合于创伤弧菌感染临床标本检测的需要。编码溶细胞素(eytolysin)的vvhA基因广泛存在于致病性创伤弧菌中且有高度的种属特异性。本研究在常规PCR检测创伤弧菌vvhA基因的基础上，建立了检测vvhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR，并以创伤弧菌DNA、目的扩增片段重组质粒及感染小鼠标本中提取的DNA为模板，对该方法的特异性、敏感性和重复性等进行了探讨。
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1 材料与方法
1.1 菌株来源和培养
创伤弧菌临床菌株WZ01株系温州医学院本课题组成员从患者标本中分离并鉴定。用含5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂(bioMerieux)及高盐碱性蛋白胨水培养基(35 g/L氯化钠、20 g/L碱性蛋白胨，pH 8.64)培养创伤弧菌。将创伤弧菌分离划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上，37℃培养24 h，挑取单个菌落接种于高盐碱性蛋白胨水培养基，37℃培养24 h。大肠杆菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌、志贺痢疾杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、霍乱弧菌均由浙江大学医学院微生物室提供，用LB培养基常规培养。
1.2细菌DNA模板的制备
绌菌新鲜培养物以5000 r/min离心15 min后收集，按细菌基因组DNA抽提试剂盒(BioColor)说明书提取DNA。按通用型基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa)说明书提取创伤弧菌感染小鼠组织中的DNA。提取的DNA溶于TE缓冲液中，用分光光度法测定其浓度和纯度后-20℃保存备用。
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1.3 PCR引物设计
分析GenBank中创伤弧菌vvhA基因核苷酸序列并参照文献[10]，采用Primer Express软件设计用于vvhA基因检测的引物和探针(表1)。实时荧光定量PCR各引物序列位于序列保守区，Tm值差异小于1℃；探针Tm值较引物高10℃左右，5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记TAMRA荧光淬灭基团。所有引物和探针均由Invitrogen生物技术有限公司合成。见表1。
1.4 vvhA基因片段的扩增、克隆和测序
扩增vvhA基因100 bp片段的PCR反应体积为50 μl，内含4 mol/L各dNTP、400 nmol/L各引物、1.5 mol/L MgCl22、EX-Taq酶2.5 U(TaKaRa)、200ng DNA模板、1*PCR缓冲液(pH 8.3)；PCR参数：94℃5 min；94℃30 s、58℃30 s、72℃60 s，35个循环；72℃7 min。分别用1μg/ml溴乙锭预染色的2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的扩增条带预期大小为100 bp。用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa)提纯扩增产物，连接于质粒pMD19-T并转化至E.coli DH5c~中，LB培养基37℃培养过夜，挑取单个菌落100 cc水浴5 min后作为模板，用PCR扩增目的片段进行初步鉴定，委托BioAsia公司测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列。
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1.5 TaqMan实时荧光定量PCR
经反复试验后确定反应体积为20μl，在TaKaRa公司用于TaqMan时荧光定量PCR的PremixEx Taq TM扩增液(内含4 mol/L各dNTP、7.5mmol/L MgCl2、EX-Taq酶1.25 u，pH 8.3)中，加入0.4μmol/L各引物、0.3μmol/L探针、5μl模板，然后用MJ Research OpticonTM Ⅱ荧光定量PCR仪在60℃时进行单点荧光检测，反应参数：95℃10 s；95℃5 s、60℃35 s，40个循环。
1.6 TaqMan实时荧光定量PCR特异性、敏感性和重复性检测
采用质粒抽提试剂盒(BioColor)提取重组质粒pMD19-T-vvhAl00，溶于TE缓冲液中用分光光度法测定质粒DNA浓度和纯度，分别用5 μlTE缓冲液连续10倍稀释的重组质粒(1.0×102～1.0×107copies/μ1)、创伤弧菌DNA(0.2-200.0 ng/μ1)为
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