密度感知系统对铜绿假单胞菌感染的免疫作用(1)
[摘要]目的研究密度感知信号(Qs)系统在铜绿假单胞(PA)菌致大鼠肺部感染中的免疫调节作用，探讨其作用机制。方法 (1)300只健康清洁级sD大鼠随机分为3组，应用锐孔喷射装置，制成两株铜绿假单孢菌(野生型铜绿假单孢菌PA01及密度感知基因缺失的变异株PA01.JP2)藻酸盐包裹体凝胶小珠，接种至大鼠肺部，建立两组慢性肺部感染模型，以无菌生理盐水一藻酸盐包裹体接种组作为对照组。(2)在接种后3、7、14、28 d，取每组大鼠肺组织匀浆和血清检测，比较各组大鼠肺组织中免疫学指标IFN-γ、IL-4及血清中IgG、IgM、IgGl、IgG2a的不同，评价两株菌的致病差异性。结果 (1)PAOI感染组大鼠死亡率(29.7%)明显高于PAO1-JP2感染组(11.0%)。(2)与PAO-JP2组相比，在感染早期(第3天)，PAO1组肺组织中IFN-γ明显升高；在感染的中期(第7天)，PAOI组IFN-γ、IL-4均显著升高，感染的后期(第14-28天)，PAO1组IFN-γ、IgG2a持续降低，IL-4、IgG、IgGl则持续升高。结论 Qs系统通过干预机体免疫系统和调控致病因子，在PA菌致病及免疫调节中起重要作用。
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[关键词]密度感知系统；铜绿假单孢菌；N-乙酰同型丝氨酸内酯
日益增多的广谱抗菌药物的应用，产生了细菌多药耐药、菌群失调等负面作用，使抗菌药物受到了很大挑战。这促使研究者们注意到通过减低细菌毒力来控制感染。而细菌密度感知信号(QuorumSensing，Qs)系统的发现则极有可能提供了这样的目标位点，此系统通过释放信号因子(Autoinduce，AI)来调节许多毒性因子的表达。应用AI拮抗剂，即可抑制细菌的致病因子、减弱其毒力，并极易被宿主免疫系统清除，以达到抗感染治疗的目的。国外关于铜绿假单孢菌(PA)QS系统的体外分子水平分析研究进步很快，但是探讨其在体内致病机制、尤其是慢性肺部感染中所起的免疫调节作用的研究相对较少。本研究以此为切入点，通过比较野生型PA菌株PAO1(含LasR.LasI和RhlR-RhlI基因)及其QS系统缺失的变异菌株PAO1-JP2(LasR-LasI和RhlR-RhlI基因均缺失，不表达N-乙酰同型丝氨酸内酯，AHIS)在大鼠肺部感染中的致病性及免疫细胞因子表达的差异，阐明Qs系统在PA菌呼吸道感染中所起的致病及免疫调节作用，并探讨其机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1动物健康清洁级Sprague—Dawley(sD)大鼠300只，体重180-220 g，7周龄，雌雄各半，由解放军总医院动物中心提供。随机分为3组，分别为PA01感染组，PA01-JP2感染组，无菌藻酸盐对照组。
1.1.2菌株PA菌株两株，由丹麦哥本哈根大学吴红博士提供。分别是可以表达AHIS的野生型菌株PAO1及其不表达AHLS的变异菌株PAO1-JP2。
1.1.3 主要试剂和仪器 藻酸盐(sigma公司，美国)，大鼠IFN-γ、IL-4定量ELISA测定试剂盒(R&D公司，美国)，锐孔喷射装置(中国科学院低温中心)，比浊仪(biomerieux，法国)，显微病理成像分析系统(OLYMPUS，日本)
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1.2 实验方法
1.2.1 PA菌藻酸盐包被体的制备
将藻酸盐粉末溶解在0.9%NaCl中，质量浓度为11 mg/ml，高压灭菌，新鲜培养18 h的细菌培养物1 ml，与9 ml无菌藻酸盐溶液混合，用比浊仪调节菌落最终浓度为3麦氏单位。混悬液放入锐孔喷射装置的圆柱形容器中，容器上方、侧壁、下方分别有三个小孔(3 mm*3 mm)。容器的上方小孔接入压缩空气，推动混悬液向下方小孔流动，在距容器底部下方小孔1 cm处的侧壁孔接入压缩空气，液体流过此处时，压缩空气流将其吹起，使之通过下方小孔针头时，形成藻酸盐飞滴，飞滴直接进入0.1 mol/L的CaCl2/TRIS-HCL缓冲液中，即成直径约60-100μm小珠子。藻酸盐珠在钙浴中持续搅动1h，离心弃上清，调节菌液浓度约为5*108。相差镜下观察PA菌藻酸盐包被小珠形态。对照组无菌的小珠使用同样的方法和步骤制作，内容物为无菌的生理盐水。
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1.2.2动物模型的建立
1.2.2.1 接种 大鼠用20%乌拉坦麻醉后固定，用16号钝头针头从口腔插入气管，将配好的藻酸盐包被的PA菌悬液或无菌悬液0.2 ml缓慢注入气管，左右旋转体位，使菌液均匀分布于两肺。
1.2.2.2监测指标在感染前、感染后3 d、7 d、14 d、28 d五个时间点每组分别选20只大鼠，取血3 ml离心，测定血清中抗PA菌抗体IgG、IgM、IgGl、IgG2a的含量。之后注射致死剂量的20%乌拉坦处死，分离出肺组织，分别进行肺组织匀浆活菌计数和病理组织学指标的检测以确立肺炎模型的建立，剩余的肺组织匀浆用于检测IFN-7、IL-4含量。
1.2.3肺组织匀浆中IFN-γ、IL-4含量测定
大鼠IFN-γ7、IL-4定量ELISA测定试剂盒(美国R&D公司)。内含96孔微孔板、标准品、生物素化抗大鼠IFN-γ/IL-4、酶标记物Streptavidin/HRP、OPD、终止液2NH2SO4。按照试剂盒说明进行操作和测定。
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1.2.4血清中抗PA菌抗体IgG、IgGl、IgG2a含量
测定
新鲜培养的PA菌标准株，调节至3麦氏浓度，冰浴下超声裂解。按280 nm(A280)光吸收法测定蛋白质浓度，以包被液调节抗原浓度到10μg/ml。用PA菌抗原200~1包被酶标板，剂量2μg/孔。4℃放置过夜。次日清洗，甩干。经过封闭、加入待测血清、山羊抗大鼠-HRP，显色等步骤后，加入H2SO4终止反应，酶标仪450 nm波长测定OD值。以样本OD值/正常大鼠血清OD值表示抗体值。
1.3统计方法
应用Stata 7.0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用方差分析组间两两比较采用SNk.口检验，率的比较采用x2。检验，以P2=27.71，P0.05)。
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[关键词]密度感知系统；铜绿假单孢菌；N-乙酰同型丝氨酸内酯
日益增多的广谱抗菌药物的应用，产生了细菌多药耐药、菌群失调等负面作用，使抗菌药物受到了很大挑战。这促使研究者们注意到通过减低细菌毒力来控制感染。而细菌密度感知信号(QuorumSensing，Qs)系统的发现则极有可能提供了这样的目标位点，此系统通过释放信号因子(Autoinduce，AI)来调节许多毒性因子的表达。应用AI拮抗剂，即可抑制细菌的致病因子、减弱其毒力，并极易被宿主免疫系统清除，以达到抗感染治疗的目的。国外关于铜绿假单孢菌(PA)QS系统的体外分子水平分析研究进步很快，但是探讨其在体内致病机制、尤其是慢性肺部感染中所起的免疫调节作用的研究相对较少。本研究以此为切入点，通过比较野生型PA菌株PAO1(含LasR.LasI和RhlR-RhlI基因)及其QS系统缺失的变异菌株PAO1-JP2(LasR-LasI和RhlR-RhlI基因均缺失，不表达N-乙酰同型丝氨酸内酯，AHIS)在大鼠肺部感染中的致病性及免疫细胞因子表达的差异，阐明Qs系统在PA菌呼吸道感染中所起的致病及免疫调节作用，并探讨其机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1动物健康清洁级Sprague—Dawley(sD)大鼠300只，体重180-220 g，7周龄，雌雄各半，由解放军总医院动物中心提供。随机分为3组，分别为PA01感染组，PA01-JP2感染组，无菌藻酸盐对照组。
1.1.2菌株PA菌株两株，由丹麦哥本哈根大学吴红博士提供。分别是可以表达AHIS的野生型菌株PAO1及其不表达AHLS的变异菌株PAO1-JP2。
1.1.3 主要试剂和仪器 藻酸盐(sigma公司，美国)，大鼠IFN-γ、IL-4定量ELISA测定试剂盒(R&D公司，美国)，锐孔喷射装置(中国科学院低温中心)，比浊仪(biomerieux，法国)，显微病理成像分析系统(OLYMPUS，日本)
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1.2 实验方法
1.2.1 PA菌藻酸盐包被体的制备
将藻酸盐粉末溶解在0.9%NaCl中，质量浓度为11 mg/ml，高压灭菌，新鲜培养18 h的细菌培养物1 ml，与9 ml无菌藻酸盐溶液混合，用比浊仪调节菌落最终浓度为3麦氏单位。混悬液放入锐孔喷射装置的圆柱形容器中，容器上方、侧壁、下方分别有三个小孔(3 mm*3 mm)。容器的上方小孔接入压缩空气，推动混悬液向下方小孔流动，在距容器底部下方小孔1 cm处的侧壁孔接入压缩空气，液体流过此处时，压缩空气流将其吹起，使之通过下方小孔针头时，形成藻酸盐飞滴，飞滴直接进入0.1 mol/L的CaCl2/TRIS-HCL缓冲液中，即成直径约60-100μm小珠子。藻酸盐珠在钙浴中持续搅动1h，离心弃上清，调节菌液浓度约为5*108。相差镜下观察PA菌藻酸盐包被小珠形态。对照组无菌的小珠使用同样的方法和步骤制作，内容物为无菌的生理盐水。
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1.2.2动物模型的建立
1.2.2.1 接种 大鼠用20%乌拉坦麻醉后固定，用16号钝头针头从口腔插入气管，将配好的藻酸盐包被的PA菌悬液或无菌悬液0.2 ml缓慢注入气管，左右旋转体位，使菌液均匀分布于两肺。
1.2.2.2监测指标在感染前、感染后3 d、7 d、14 d、28 d五个时间点每组分别选20只大鼠，取血3 ml离心，测定血清中抗PA菌抗体IgG、IgM、IgGl、IgG2a的含量。之后注射致死剂量的20%乌拉坦处死，分离出肺组织，分别进行肺组织匀浆活菌计数和病理组织学指标的检测以确立肺炎模型的建立，剩余的肺组织匀浆用于检测IFN-7、IL-4含量。
1.2.3肺组织匀浆中IFN-γ、IL-4含量测定
大鼠IFN-γ7、IL-4定量ELISA测定试剂盒(美国R&D公司)。内含96孔微孔板、标准品、生物素化抗大鼠IFN-γ/IL-4、酶标记物Streptavidin/HRP、OPD、终止液2NH2SO4。按照试剂盒说明进行操作和测定。
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1.2.4血清中抗PA菌抗体IgG、IgGl、IgG2a含量
测定
新鲜培养的PA菌标准株，调节至3麦氏浓度，冰浴下超声裂解。按280 nm(A280)光吸收法测定蛋白质浓度，以包被液调节抗原浓度到10μg/ml。用PA菌抗原200~1包被酶标板，剂量2μg/孔。4℃放置过夜。次日清洗，甩干。经过封闭、加入待测血清、山羊抗大鼠-HRP，显色等步骤后，加入H2SO4终止反应，酶标仪450 nm波长测定OD值。以样本OD值/正常大鼠血清OD值表示抗体值。
1.3统计方法
应用Stata 7.0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用方差分析组间两两比较采用SNk.口检验，率的比较采用x2。检验，以P2=27.71，P0.05)。
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