促红细胞生成素对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用(1)
摘要：目的探讨促红细胞生成素(EPO)对心肌细胞缺氧/复氧(HR)损伤的保护作用及其机制。方法对乳鼠心肌细胞进行原代分离培养，并缺氧2h，复氧1h，建立HR损伤模型。心肌细胞随机分为四组：正常细胞培养组(空白组)，HR组，HR+EP010U/ml组(EPO组)，HR+EPO10U/ml+UO12610μmol/L组(uo126组)。全自动生化分析仪检测各组细胞培养液LDH活性；MTT法检测心肌细胞活性；TuNEL法：流式细胞仪Armexin-v-FITC法检测凋亡心肌细胞；Western-blot法测定各组心肌细胞ERK和磷酸化ERK蛋白含量。结果 EPO显著降低心肌细胞HR损伤后LDH的漏出，增强细胞的活性，减少细胞的凋亡比例，提高ERK蛋白磷酸化水平；而经过126(MAPK的阻滞剂)的处理，心肌细胞LDH外溢量增加，细胞活性显著下降，凋亡细胞的比例明显增加，且ERK蛋白磷酸化水平显著降低。结论EPO对心肌细胞HR损伤有一定的保护作用，其机制与ERK信号通路的激活及抑制心肌细胞凋亡有关。
关键词：促红细胞生成素：缺氧/复氧损伤；凋亡；丝裂原活化蛋白激酶
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促红细胞生成素(erythrpoletin，EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素。临床上，重组人红细胞生成素(rhEPo)已被广泛用于治疗各类贫血。近来研究发现，EPO还具有抗凋亡，促血管生成，调节炎症反应等作用，对多种器官有保护作用，但对于其在心肌缺血-再灌注损伤(myocardialischemia-reperfusion MIRI)方面的研究于2004年始有报道。本实验通过建立乳鼠心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation，HR)损伤模型在体外模拟MIRI的过程，研究EPO对MIRI的保护作用，并探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1材料
注射用促红细胞生成素(商品名依倍，成都地奥制药有限公司，批号A20050402)，厌氧培养盒，厌氧产气袋(Blomerleux，法国)，RIPA(能博彩生物，上海)，UO126(康成生物，上海)，p44/42MAPK抗体，磷酸化p44/42 MAPK抗体(Cellsignaling Technology，美国)，流式细胞仪(B&D公司，美国)，Annexin-V-FITC凋亡检测测试盒(BlOViSion公司，美国)。
, 百拇医药
1.2方法
参照文献[3]方法，取初生1～3 d的Sprague-Dawley乳鼠，在无菌条件下取出心脏，将心肌组织剪成l～2mm的碎块，0.125%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，利用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，接种到培养瓶中孵箱中培养，接种3d后进行下一步实验。
心肌缅胞HR模型的制作参照文献[4]方法并加以改进，将培养板置入厌氧培养盒中，同时放入厌氧产气袋，造成缺氧环境(O22：孵箱中继续培养60min。实验分为四组：正常细胞培养组(空白组)；HR组；HR+EPO 10U/ml组(EPO组)；HR+EPO 10 U/ml+U0126 10tzmol/L组(U0126组)。
1.3测定指标
1.3.1 LDH活性取0.5细胞培养上清液用全自动生化分析仪检测LDH活性。
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1.3.2 MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法检测心肌细胞活性各组细胞中加入MTI"溶液(5 rag/m1)20后继续培养4h，弃培养上清，各孔加入150二甲基亚砜(DMSO)、室温振荡10min、HT27000PMS多孔读数仪492nm处读取吸光度值，以DMEM培养液作空白调零。实验结果：心肌细胞活性以MTT代谢率表示。
MTF代谢率(%)=实验组吸光度值/空白组吸光度值
1.3.3 TUNEL法(原位末端标记法)检测心肌细胞凋亡率实验结束后取出细胞爬片，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，按TUNEL试剂盒说明书操作。高倍显微镜下检测凋亡心肌细胞，细胞核中有棕黄色颗粒，核固缩成团，聚集呈环状或碎裂，形成凋亡小体者为阳性细胞。每张爬片随机选取10个视野(×40)，计数至少100个细胞，通过公式计算凋亡指数(Apoptotie Index，AI)。
AI=凋亡阳性细胞数/总细胞计数×100%
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1.3.4 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率 按Annexin-V-FITC凋亡检测测试盒步骤操作：各组细胞用PBS洗2遍，Binding缓冲液调整细胞至1×10/ml，吸取100，加Annexin-V-FITC 5，碘化丙啶(H)5，避光孵育15min，用流式细胞仪检测凋亡率。
1.3 5免疫印迹(Western-blot)法测定ERKI和磷酸化ERKI蛋白含量分别取处理后四组细胞，RIPA液提取蛋白；取等量蛋白经SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺凝胶)电泳分离后，将其转移到硝酸纤维素膜上。封闭，洗膜3次后加入一抗(p44/42 MAPK抗体，或P-p44/42 MAPK抗体)，37℃孵育2h加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育40 min，冲洗，显色，曝光，胶片显影。蛋白条带的光密度值采用Smart View Analys isProgram测定。
1.4统计学方法
所有数据应用SPSS 软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差，组间数据比较用方差分析，两两比较用Student-Newman-Keuis法。计数资料采用检验，两两比较用分割法。以P
[ 下 页 ], http://www.100md.com(杨迪成 肖明第等)
关键词：促红细胞生成素：缺氧/复氧损伤；凋亡；丝裂原活化蛋白激酶
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促红细胞生成素(erythrpoletin，EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素。临床上，重组人红细胞生成素(rhEPo)已被广泛用于治疗各类贫血。近来研究发现，EPO还具有抗凋亡，促血管生成，调节炎症反应等作用，对多种器官有保护作用，但对于其在心肌缺血-再灌注损伤(myocardialischemia-reperfusion MIRI)方面的研究于2004年始有报道。本实验通过建立乳鼠心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation，HR)损伤模型在体外模拟MIRI的过程，研究EPO对MIRI的保护作用，并探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1材料
注射用促红细胞生成素(商品名依倍，成都地奥制药有限公司，批号A20050402)，厌氧培养盒，厌氧产气袋(Blomerleux，法国)，RIPA(能博彩生物，上海)，UO126(康成生物，上海)，p44/42MAPK抗体，磷酸化p44/42 MAPK抗体(Cellsignaling Technology，美国)，流式细胞仪(B&D公司，美国)，Annexin-V-FITC凋亡检测测试盒(BlOViSion公司，美国)。
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1.2方法
参照文献[3]方法，取初生1～3 d的Sprague-Dawley乳鼠，在无菌条件下取出心脏，将心肌组织剪成l～2mm的碎块，0.125%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，利用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，接种到培养瓶中孵箱中培养，接种3d后进行下一步实验。
心肌缅胞HR模型的制作参照文献[4]方法并加以改进，将培养板置入厌氧培养盒中，同时放入厌氧产气袋，造成缺氧环境(O22：孵箱中继续培养60min。实验分为四组：正常细胞培养组(空白组)；HR组；HR+EPO 10U/ml组(EPO组)；HR+EPO 10 U/ml+U0126 10tzmol/L组(U0126组)。
1.3测定指标
1.3.1 LDH活性取0.5细胞培养上清液用全自动生化分析仪检测LDH活性。
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1.3.2 MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法检测心肌细胞活性各组细胞中加入MTI"溶液(5 rag/m1)20后继续培养4h，弃培养上清，各孔加入150二甲基亚砜(DMSO)、室温振荡10min、HT27000PMS多孔读数仪492nm处读取吸光度值，以DMEM培养液作空白调零。实验结果：心肌细胞活性以MTT代谢率表示。
MTF代谢率(%)=实验组吸光度值/空白组吸光度值
1.3.3 TUNEL法(原位末端标记法)检测心肌细胞凋亡率实验结束后取出细胞爬片，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，按TUNEL试剂盒说明书操作。高倍显微镜下检测凋亡心肌细胞，细胞核中有棕黄色颗粒，核固缩成团，聚集呈环状或碎裂，形成凋亡小体者为阳性细胞。每张爬片随机选取10个视野(×40)，计数至少100个细胞，通过公式计算凋亡指数(Apoptotie Index，AI)。
AI=凋亡阳性细胞数/总细胞计数×100%
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1.3.4 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率 按Annexin-V-FITC凋亡检测测试盒步骤操作：各组细胞用PBS洗2遍，Binding缓冲液调整细胞至1×10/ml，吸取100，加Annexin-V-FITC 5，碘化丙啶(H)5，避光孵育15min，用流式细胞仪检测凋亡率。
1.3 5免疫印迹(Western-blot)法测定ERKI和磷酸化ERKI蛋白含量分别取处理后四组细胞，RIPA液提取蛋白；取等量蛋白经SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺凝胶)电泳分离后，将其转移到硝酸纤维素膜上。封闭，洗膜3次后加入一抗(p44/42 MAPK抗体，或P-p44/42 MAPK抗体)，37℃孵育2h加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育40 min，冲洗，显色，曝光，胶片显影。蛋白条带的光密度值采用Smart View Analys isProgram测定。
1.4统计学方法
所有数据应用SPSS 软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差，组间数据比较用方差分析，两两比较用Student-Newman-Keuis法。计数资料采用检验，两两比较用分割法。以P
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