氨溴索增强左氧氟沙星在铜绿假单胞菌生物被膜形成时的杀菌作用(2)
【Key words】Pseudomonas aeruginosa；Biofilm；Ambroxol；Levofloxacin；Bactericidal effect
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa， P.a)是院内感染和致命感染的最常见病原菌，它可引起一系列急性和慢性感染[1]。P.a有多种生存策略，最主要的是能形成生物被膜(biofilm，BF)。Zhao和Liu[2]报道化痰药N-乙酰半胱氨酸可以抑制细菌在物体表面的黏附，减少和预防形成BF，显示出BF抑制剂的特性。盐酸氨溴索(ambroxol， AMB)是临床广泛应用于各科的药物之一，有溶解粘蛋白、抗炎和抗氧化作用[3]，其作用机制和N-乙酰半胱氨酸有相似之处。但是，对BF的作用，目前还不完全清楚。本研究针对这一问题进行了探讨。
1 材料与方法
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1.1 材料
载体为医用输液管(截为10 mm，备用)。实验菌株为P.a野生株PAO1(由丹麦哥本哈根大学临床微生物研究室提供)；ATCC 27853(广西医科大学第一附属医院微生物室提供)。培养基及药物：LB(Luria-Bertani)(Sigma公司)；盐酸氨溴索(批号：100599-200502，中国药品生物制品检验所)；左氧氟沙星(LFX，批号：130537-200301，中国药品生物制品检验所)。仪器：恒温摇晃培养箱(中国科学院武汉科学仪器厂)；SPX型智能生化培养箱(宁波江南仪器厂)；台式低温高速离心机(5410R，德国Eppendof)；超声震荡清洗机[B-2500 S-MTH 必能信超声(上海)有限公司]；扫描电镜(S-800日本)。
1.2 方法
1.2.1 药物对PAO1最低抑菌浓度(MIC)的测定 试管二倍稀释法测定LFX和AMB对实验菌株PAO1野生株的MIC，同时平行测定其对质控菌株ATCC 27853的MIC作质量控制。敏感性分类和质量控制均采用美国临床检验标准委员会推荐标准。
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1.2.2 生物被膜体外模型的制备 细菌BF的制备：按文献[4]方法，采用输液管为载体进行BF 的培养。取隔夜培养的含有PAO 1 的肉汤， 比浊仪调定为0.5麦氏单位， 吸取0.1 ml菌液种入到含有4.9 ml LB液及10 mm输液管载体的24孔板中， 37 ℃培养， 隔日更换LB液，培养3 d得到早期BF，培养7 d 得到成熟BF。
1.2.3 扫描电镜标本的处理与观察 将输液管在2.5%戊二醛中固定，PBS中漂洗，梯度乙醇脱水，真空喷镀金粉。观察与摄片条件： 电压20 kV ，放大倍数：3750。
1.2.4 P.a 的BF内存活菌菌落计数 取出输液管载体，10 ml生理盐水冲洗载体表面的浮游菌，然后放入加有2 ml无菌生理盐水的小试管中，超声震荡10 min脱膜，涡旋1 min使菌液充分混匀。连续稀释法进行载体表面活菌计数计算细菌浓度，然后换算输液管细菌计数的常用对数。结果用均数±标准差(x±s)表示，每次测定均重复测3 次计算平均值。
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1.2.5 AMB和LFX联合用药方法 分别设置空白对照组、LFX组、以及LFX+AMB组，每组6份载体。LFX终质量浓度为1 μg/ml，AMB终质量浓度分别为256 μg/ml、512 μg/ml。空白对照组使用无菌生理盐水。将上述各组药物加入24孔培养板中，每孔液体为2 ml。将附有早期或者成熟BF的输液管经无菌生理盐水充分漂洗后放入各孔中，37 ℃孵育24 h。
1.3 统计学方法
采用SPSS for windows 13.0 统计软件进行分析处理。采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 药物最低抑菌质量浓度(MIC)的测定结果
LFX对PAO1及ATCC27853的MIC均为0.5 μg/ml。AMB对PAO1及ATCC27853的MIC均为2048 μg/ml。
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2.2 AMB对BF的破坏作用的SEM观察结果
早期或者成熟的BF，经过和512 μg/ml的氨溴索作用24 h以后，发现载体表面早期BF可以见大量聚集成堆的菌体，菌体表面黏液样物质明显减少。成熟BF中菌体轮廓模糊，被黏液样物质包绕，但仍可见游离细菌，黏液样物质变稀薄。如图1。
2.3 AMB与LFX联用对BF内P.a的影响
在建立体外P.a早期和成熟的BF，用LFX和不同质量浓度的AMB在37 ℃联合作用24 h后，进行BF内活菌计数，见表1。统计分析结果显示，不论是早期BF，还是成熟期BF，单独使用LFX时，其载体BF内活菌计数和空白对照组差异具有统计学意义(P<0.05)，说明单独使用LFX对早期和成熟BF内P.a均有一定的清除作用。对于早期BF，LFX联合不同质量浓度的AMB，载体BF内P.a均较LFX单独使用时减少(P<0.05)；并且，随着AMB质量浓度的增加，对BF内P.a的清除作用更明显(P<0.05)。对于成熟BF，LFX联合256 μg/ml的AMB时，BF内P.a活菌计数和单独使用LFX组差异无统计学意义(P>0.05)；当LFX联合的AMB质量浓度增加至512 μg/ml时，则BF内活菌计数明显降低(P<0.05)。
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3 讨论
P.a可以引起急性或慢性感染，增加了发病率和病死率。形成BF是P.a对抗生素耐药的重要方式之一。当其生长条件恶劣时，P.a形成BF附着于周围的无生命物质或者机体组织， 这是P.a为了适应环境、维持自身生存所发生的适应性变化。一旦形成BF，抗生素即使剂量增加数倍，仍难凑效。故在P.a导致的慢性难治性感染中，BF高度耐药与BF结构有密切关系[5]。细菌BF中，胞外多糖纤维或多糖-蛋白质复合体纠缠在一起并交错成立体网状，间隙内充满了带有负电荷的藻酸盐，形成黏稠致密的黏液样物质，它们构成细菌生长的外环境，形成坚固的弥散屏障，阻碍了抗生素的渗透和弥散[5]。在这种状态下，抗菌药物只能杀灭表层细菌，而无法以有效浓度渗透至深部细菌之中，成为慢性感染的重要原因。, http://www.100md.com(孔晋亮 蔡双启 陈一强 闫萍 张东伟 简丽娟 吴海英)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa， P.a)是院内感染和致命感染的最常见病原菌，它可引起一系列急性和慢性感染[1]。P.a有多种生存策略，最主要的是能形成生物被膜(biofilm，BF)。Zhao和Liu[2]报道化痰药N-乙酰半胱氨酸可以抑制细菌在物体表面的黏附，减少和预防形成BF，显示出BF抑制剂的特性。盐酸氨溴索(ambroxol， AMB)是临床广泛应用于各科的药物之一，有溶解粘蛋白、抗炎和抗氧化作用[3]，其作用机制和N-乙酰半胱氨酸有相似之处。但是，对BF的作用，目前还不完全清楚。本研究针对这一问题进行了探讨。
1 材料与方法
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1.1 材料
载体为医用输液管(截为10 mm，备用)。实验菌株为P.a野生株PAO1(由丹麦哥本哈根大学临床微生物研究室提供)；ATCC 27853(广西医科大学第一附属医院微生物室提供)。培养基及药物：LB(Luria-Bertani)(Sigma公司)；盐酸氨溴索(批号：100599-200502，中国药品生物制品检验所)；左氧氟沙星(LFX，批号：130537-200301，中国药品生物制品检验所)。仪器：恒温摇晃培养箱(中国科学院武汉科学仪器厂)；SPX型智能生化培养箱(宁波江南仪器厂)；台式低温高速离心机(5410R，德国Eppendof)；超声震荡清洗机[B-2500 S-MTH 必能信超声(上海)有限公司]；扫描电镜(S-800日本)。
1.2 方法
1.2.1 药物对PAO1最低抑菌浓度(MIC)的测定 试管二倍稀释法测定LFX和AMB对实验菌株PAO1野生株的MIC，同时平行测定其对质控菌株ATCC 27853的MIC作质量控制。敏感性分类和质量控制均采用美国临床检验标准委员会推荐标准。
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1.2.2 生物被膜体外模型的制备 细菌BF的制备：按文献[4]方法，采用输液管为载体进行BF 的培养。取隔夜培养的含有PAO 1 的肉汤， 比浊仪调定为0.5麦氏单位， 吸取0.1 ml菌液种入到含有4.9 ml LB液及10 mm输液管载体的24孔板中， 37 ℃培养， 隔日更换LB液，培养3 d得到早期BF，培养7 d 得到成熟BF。
1.2.3 扫描电镜标本的处理与观察 将输液管在2.5%戊二醛中固定，PBS中漂洗，梯度乙醇脱水，真空喷镀金粉。观察与摄片条件： 电压20 kV ，放大倍数：3750。
1.2.4 P.a 的BF内存活菌菌落计数 取出输液管载体，10 ml生理盐水冲洗载体表面的浮游菌，然后放入加有2 ml无菌生理盐水的小试管中，超声震荡10 min脱膜，涡旋1 min使菌液充分混匀。连续稀释法进行载体表面活菌计数计算细菌浓度，然后换算输液管细菌计数的常用对数。结果用均数±标准差(x±s)表示，每次测定均重复测3 次计算平均值。
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1.2.5 AMB和LFX联合用药方法 分别设置空白对照组、LFX组、以及LFX+AMB组，每组6份载体。LFX终质量浓度为1 μg/ml，AMB终质量浓度分别为256 μg/ml、512 μg/ml。空白对照组使用无菌生理盐水。将上述各组药物加入24孔培养板中，每孔液体为2 ml。将附有早期或者成熟BF的输液管经无菌生理盐水充分漂洗后放入各孔中，37 ℃孵育24 h。
1.3 统计学方法
采用SPSS for windows 13.0 统计软件进行分析处理。采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 药物最低抑菌质量浓度(MIC)的测定结果
LFX对PAO1及ATCC27853的MIC均为0.5 μg/ml。AMB对PAO1及ATCC27853的MIC均为2048 μg/ml。
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2.2 AMB对BF的破坏作用的SEM观察结果
早期或者成熟的BF，经过和512 μg/ml的氨溴索作用24 h以后，发现载体表面早期BF可以见大量聚集成堆的菌体，菌体表面黏液样物质明显减少。成熟BF中菌体轮廓模糊，被黏液样物质包绕，但仍可见游离细菌，黏液样物质变稀薄。如图1。
2.3 AMB与LFX联用对BF内P.a的影响
在建立体外P.a早期和成熟的BF，用LFX和不同质量浓度的AMB在37 ℃联合作用24 h后，进行BF内活菌计数，见表1。统计分析结果显示，不论是早期BF，还是成熟期BF，单独使用LFX时，其载体BF内活菌计数和空白对照组差异具有统计学意义(P<0.05)，说明单独使用LFX对早期和成熟BF内P.a均有一定的清除作用。对于早期BF，LFX联合不同质量浓度的AMB，载体BF内P.a均较LFX单独使用时减少(P<0.05)；并且，随着AMB质量浓度的增加，对BF内P.a的清除作用更明显(P<0.05)。对于成熟BF，LFX联合256 μg/ml的AMB时，BF内P.a活菌计数和单独使用LFX组差异无统计学意义(P>0.05)；当LFX联合的AMB质量浓度增加至512 μg/ml时，则BF内活菌计数明显降低(P<0.05)。
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3 讨论
P.a可以引起急性或慢性感染，增加了发病率和病死率。形成BF是P.a对抗生素耐药的重要方式之一。当其生长条件恶劣时，P.a形成BF附着于周围的无生命物质或者机体组织， 这是P.a为了适应环境、维持自身生存所发生的适应性变化。一旦形成BF，抗生素即使剂量增加数倍，仍难凑效。故在P.a导致的慢性难治性感染中，BF高度耐药与BF结构有密切关系[5]。细菌BF中，胞外多糖纤维或多糖-蛋白质复合体纠缠在一起并交错成立体网状，间隙内充满了带有负电荷的藻酸盐，形成黏稠致密的黏液样物质，它们构成细菌生长的外环境，形成坚固的弥散屏障，阻碍了抗生素的渗透和弥散[5]。在这种状态下，抗菌药物只能杀灭表层细菌，而无法以有效浓度渗透至深部细菌之中，成为慢性感染的重要原因。, http://www.100md.com(孔晋亮 蔡双启 陈一强 闫萍 张东伟 简丽娟 吴海英)