张 霞,付海霞,郑亚莉*

    (1宁夏人民医院肾脏内科,银川 750002；2山东日照市中心医院血液净化中心,日照 276800)

    2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)属于老年退行性疾病,严重影响着人类的身体健康。细胞周期素依赖性激酶5(cyclin dependent kinase 5,Cdk5)作为Cdk家族成员,在病理情况下,由于p35裂解为p25,而被过度激活[1]。过度活化的Cdk5在神经系统可导致Tau蛋白过度磷酸化,引起神经细胞凋亡,参与神经退行性疾病的发生和进展[2]。近年研究发现,胰岛细胞中存在p35,高糖刺激可使p35表达增高,使Cdk5过度激活、抑制胰岛素分泌,而抑制该激酶活性可能发挥治疗T2DM作用[2]。前期的研究已经发现,由p35分解得到的短肽Cdk5抑制肽(Cdk5 inhibitory peptide,CIP)可抑制Cdk5活性,可能用于治疗神经退行性疾病[3]。有研究发现,T2DM与神经退行性疾病发病有着共同的病理生理机制[2,4]。本研究中,继续分解CIP得到24个氨基酸的短肽p5,连接TAT蛋白和FITC后合成TFP5,探究TFP5对高糖刺激下胰岛细胞中Cdk5活性、胰岛细胞存活和功能的影响,探讨其对T2DM的防治作用。

    1 材料与方法

    1.1 抗体和试剂

    Cdk5、p35抗体购自Santa Cruz生物公司,微管蛋白(tubulin)单克隆抗体、Bax、Bcl-2抗体和Lipofectamine基因转染试剂购自Invitrogen公司,DMEM培养液购自Gibco公司,胎牛血清购自Hyclone公司,胰岛素分泌测定酶标免疫试剂盒购自Linco Research公司。小鼠胰岛β细胞(Min6细胞株),由NIH,Dr.Abner Notkins’Lab赠送。TFP5肽由21st Century Biochemicals(Marlboro,MA)合成。

    1.2 细胞的培养及刺激

    Min6细胞在含有4.5g/L的葡萄糖、10%的胎牛血清、100kU/L的青霉素G和100mg/L链霉素的DMEM培养液中培养。胰岛细胞铺板于6孔培养盘(100万/孔)。次日分别用不同浓度的葡萄糖(5,25mmol/L)培养刺激,并将高糖条件下培养的细胞分别转染EV、TFP5和携带p5基因的病毒(1ml/L),48h后收取细胞和上清液 ......