细胞心肌成形术研究进展
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[摘要] 细胞心肌成形术是治疗终末性心脏病的新方法。现从移植细胞的种类、存活、分化、与宿主心肌细胞的整合、对移植区血管新生以及对宿主心脏结构和功能的影响等诸方面进行综述。
[关键词] 细胞心肌成形术;细胞移植;干细胞;心肌细胞
Research progress in cellular cardiomyoplasty
MENG Lei ，LIU Zhi-yong
(Department of Cardiothoracic Surgery，the Affiliated Xuzhou Hospital of Southeast University Medical College，Xuzhou221009，China;Department of Cardiothoracic Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract: Cellular cardiomyoplasty is a novel and promising approach in the treatment of end-stage cardiac diseases，such as myocardial infarction and heart failure.In this article，cell types used for cardiac cell transplantation，successful cell survival and differentiation after transplantation，integration into the host my-ocardium，enhanced angiogenesis，influence on host cardiac structure and function，and also the unsolved problems are discussed in both laboratory and clinic.
Key words:cellular cardiomyoplasty;cell transplantation;stem cell;cardiac myocyte
各种原因所致的心肌细胞丢失、瘢痕形成及心室重构是造成心肌功能恶化的主要因素，也是最终导致慢性充血性心力衰竭的病理基础。药物、介入和手术治疗，虽能改善心肌缺血和心力衰竭的症状，但不能使已坏死的心肌再生。心脏移植能取代受损心脏，但供体来源少，选择困难且存在免疫排斥反应，费用昂贵，故难以推广。通过移植技术将培养的细胞植入损伤的心肌以替代坏死的心肌，从而改善心脏功能，是近年来发展起来的新技术，有望成为治疗终末期心脏病的良好选择，这种方法也被称为细胞心肌成形术。Koh等 [1] 报道将成肌细胞C2C12系成功移植至正常小鼠的心脏，并观察到形成具有成熟骨骼肌细胞特征的多核肌管。1994年Soonpaa等 [2] 将小鼠胚胎细胞移植至正常小鼠的心脏中，发现移植细胞存活分化，并与宿主心肌细胞形成闰盘连接，初步证实了心脏细胞移植的可行性。自体、异体甚至异种的多种细胞移植，均获得令人鼓舞的结果:移植细胞存活，与宿主心肌整合，心功能提高，血管新生。然而，其机制不明，而且没有足够的对比研究显示何种细胞类型更好，作者对此综述如下。
1 心肌细胞移植
Li等 [3] 将胎鼠心肌细胞移植到成年鼠腿部皮下组织形成了心肌组织和细胞连接，能自发和规律收缩，且与心室自身节律相同，至少可维持3个月。Li等 [4] 又将胎鼠心肌细胞移植到心肌瘢痕中，4周后瘢痕面积较对照组缩小，移植细胞形成了能收缩的心肌组织，移植细胞间通过闰盘连接，并见血管和淋巴细胞，收缩压和发展压升高。Koh等移植AT.1心肌细胞到同基因鼠心，也发现移植细胞可生存和增殖 [5] ，而且与宿主心肌细胞形成了缝隙连接 [2] 。1995年Van Meter等 [6] 分别将大鼠心房瘤细胞、新生猪心肌细胞和人类胎儿心肌细胞注射到成年猪左室前后壁，同时每日2次静脉注射环孢霉素15mg·kg -1 抗排斥反应。1个月后移植的心肌细胞生长旺盛，无明显排斥反应，移植细胞与宿主心肌细胞间形成类似新生闰盘的紧密连接，而且有血管新生，从而表明大型动物模型同种异体及异种成肌细胞移植的可行性。但人胎儿心室肌细胞和胎鼠心室肌细胞在大鼠心梗区似乎仍保持胎儿细胞表型，最终是否分化成成熟心肌细胞仍不清楚 [7] 。Rei-necke等 [8] 比较了近交胎鼠、新生鼠、成年鼠心肌细胞移植的效果，将这些细胞分别移植到正常心肌、急性冰冻损伤的心肌或肉芽组织，结果成年心肌细胞均未见生存，而胎鼠和新生鼠心肌细胞均存活。黏附连接蛋白N.钙黏蛋白和缝隙连接蛋白43(connexin.43，CX43)表达阳性，心肌细胞间形成成熟闰盘。
尽管使用免疫抑制剂，异体或异种胎儿心肌细胞仍会受到免疫排斥，移植的心肌细胞最终被排斥消失 [6] 。由于使用人类胎儿心肌细胞会引起伦理问题，移植AT.1心肌细胞 [5] 或者C2C12成肌细胞 [1] 有形成肿瘤的可能，因而限制了临床应用。Sakai等 [9] 尝试采用成年雄性大鼠自体左房心肌细胞，体外扩增后注射到心肌瘢痕中，移植的心肌细胞在瘢痕中存活，无淋巴细胞浸润，但未形成典型心肌结构，细胞排列方向与心肌不一致。尽管如此，移植的心肌细胞限制了瘢痕扩张变薄，心功能得到提高。
2 骨髓细胞移植
骨髓间充质不仅是造血干细胞分化成熟的微环境，而且存在着比造血干细胞更原始的具有多种分化潜能的干细胞，称为间充质干细胞，可诱导分化成软骨、骨、脂肪、肌细胞，甚至心肌细胞 [10] 。
Tomita等 [11] 从成年大鼠自身获取骨髓细胞(bone marrow cells，BMCs)，培养基中分别加入5.氮杂胞苷(5.azacytidine，5.aza)、转移生长因子β 1 及胰岛素。体外研究发现只有与5.aza共培养的BMCs形成了肌管，肌钙蛋白Ⅰ和肌球蛋白重链染色阳性。移植到心肌瘢痕5周后，移植组都形成心肌样细胞，瘢痕中有血管新生，淋巴细胞浸润和免疫排斥反应不明显，无骨、软骨、脂肪及肿瘤样细胞形成。经5.aza处理的BMCs移植组的收缩压和发展压显著升高，瘢痕面积小、壁厚，左室容积/体重之值显著下降。Wang等 [12] 采集骨髓基质细胞进行培养扩增，用DAPI标记后注射到同基因大鼠心肌内。4周后移植细胞肌节肌浆球蛋白重链表达，形成收缩蛋白且连接蛋白43染色阳性，表明骨髓基质细胞来源的细胞与宿主心肌细胞通过闰盘建立了连接。Wang认为心肌微环境诱导MSCs移植后的生长和向心肌细胞分化，新生血管增多可改善冬眠心肌的血液供应，并有利于心功能改善。 骨髓干细胞移植具有特殊的吸引力，可自体移植，采集方便，能多次获取，不会引起免疫排斥反应;不存在伦理道德上的问题;定向分化能力强，可与宿主心肌细胞通过闰盘建立连接;诱导分化较易。因此现阶段，临床应用骨髓干细胞移植治疗心脏病已成为可能。
3 骨骼肌细胞移植
成体骨骼肌与心肌不同，仍保留较强再生能力，每个成熟的骨骼肌纤维都产生几个称为卫星细胞的成肌细胞，位于基膜下，保持静止未分化状态，骨骼肌受损伤后被激活，进入有丝分裂周期，彼此间及与损伤的肌纤维融合，从而修复骨骼肌的延续性及功能。
Chiu等 [13] 从成年犬获取骨骼肌后体外培养10～21d，分别用氚化胸腺嘧啶和lacZ基因标记后，移植到同一只犬的急性低温损伤心脏。4～18周行组织学及组织化学检查，移植区的横纹肌纤维有闰盘和中央核，类似心肌。作者提出“环境影响分化”假说，即成体骨骼肌的生肌细胞经历“环境影响分化”，形成了心肌细胞。兔比其它动物(鼠、犬)的心肌损伤模型更有优越性，兔的心肌收缩蛋白基因表达和侧支血管形成与人类更为相似。为此，Atkins等 [14] 从成年兔获取自体骨骼肌，培养后植入低温损伤的心肌中央或1周后的瘢痕中央。2周后观察冻伤区存在多核骨骼肌管，骨骼肌特异性转录因子Myogenin免疫组化染色分析证实为骨骼肌细胞来源。冻伤区周围可见类似未成熟心肌细胞孤立的非骨骼肌细胞团，Myogenin阴性。作者也认为邻近心肌的电、机械活动以及损伤区的微环境可能影响了植入细胞或受损心肌周围细胞的表型分化，即“环境影响分化”。Ghostine等 [15] 观察移植瘢痕区的骨骼肌成肌细胞和肌管能表达快慢两型肌球蛋白重链，胶原浓度显著减少。显示移植细胞向抗疲劳的慢抽动纤维的转化，更适合心肌的工作负荷。Scorsin等 [16] 观察到骨骼肌细胞和胚胎心肌细胞移植均能提高心功能，但骨骼肌移植组其心肌CX43为阴性，表明没有形成电机械耦合。
肌肉生物学研究显示，骨骼肌和心肌细胞之间存在不同的基本结构，可阻止卫星细胞和受体心肌细胞间的整合，骨骼肌细胞之间缺乏缝隙连接;二氢吡啶受体表型不同，由于它决定兴奋.收缩耦联，故移植后可能发生心律失常。但骨骼肌易于从自身获取，不会发生排斥反应，无伦理问题，可能更具临床应用价值。
4 平滑肌细胞移植
Li等 [17] 将胎鼠平滑肌细胞植入冷冻坏死的成年大鼠左室游离壁中，同时予环孢霉素A，8周后平滑肌肌动蛋白免疫染色结果证明，移植的平滑肌存活且形成平滑肌样组织，有血管新生。移植细胞的增生增加了瘢痕厚度，阻止了心室扩张，提高了收缩功能。不同类型肌细胞植入心肌中效果不同，自体平滑肌移植比异体心肌细胞移植更能改善扩张性心肌病大鼠的心功能 [18] 。
5 胚胎干细胞移植
胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES)是指存在于哺乳动物发育早期胚胎中的多能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力，经体外诱导后可分化为一个成熟个体中所有类型的细胞。
Min等 [19] 用绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein，GFP)标记的ES细胞移植到急性心梗的鼠心，6周后心功能明显改善，肌节α.肌动蛋白、心肌α.肌浆球蛋白重链和肌钙蛋白Ⅰ染色强阳性，梗死区GFP阳性细胞证明移植细胞的存活和分化，GFP阳性细胞呈棒状，有横纹。Yang等 [20] 又将鼠ES细胞分离的早期分化细胞(early-differentiated cells，EDCs)分成2组，用或不用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)cDNA转染，以GFP cDNA标记后植入梗死区。6周后GFP和CX.43染色阳性，心功能明显改善，梗死区血管数量显著增加，而且EDCs.VEGF组心功能更好，血管密度更高。
脐带血中也富含干细胞，明显超过成人外周血含量，相当于成人骨髓含量。脐带血来源广泛，采集方便，对供者无害;其干细胞较成人骨髓干细胞更原始，增殖分化能力强;其中的淋巴细胞免疫功能不成熟，移植后不易发生排斥反应;而且脐带血中的MSCs易于分离，因此更具有临床价值。
6 外周血干细胞移植
Kawamoto等 [21] 从健康成人外周血获取单核细胞扩增标记后，静脉注射内皮祖细胞4周后，左室及左室瘢痕显著缩小，射血分数、室壁运动、血管密度显著增加，免疫组化显示人特异性内皮细胞阳性。外周血干细胞移植与骨髓细胞移植一样具有明显优势，较适合临床应用。
7 临床试验
2001年法国Menasché等 [22] 报道首例临床试验，他们从一位广泛下壁心梗、前外侧缺血合并顽固心衰 病人的骨外侧肌取得骨骼肌，体外培养2周后，在进行冠脉搭桥的同时注射入梗死区中央及周围。随防5个月，未发现心律不齐，心功能由术前的NYHAⅢ级恢复至Ⅱ级，左室射血分数由21%上升到30%，前、后壁收缩明显改善。冠脉搭桥术前后壁无存活心肌，而术后显示有放射性元素吸收，提示该区有新的代谢活动，对此不能完全用搭桥来解释。Assmus等 [23] 分别用骨髓祖细胞及外周血祖细胞经冠状动脉输入治疗急性心梗19例，4个月后左室射血分数、梗死区室壁运动显著增加，左室收缩期末容积显著减少，FDG-PET检查确定梗死冠脉的血流储备完全正常，梗死区心肌活力显著增加，无炎症反应迹象或恶性心律不齐。
这些临床试验结果均证实自体细胞移植治疗缺血性心脏病是切实可行的，确能改善心肌梗死后的心室功能，是一很有前途的研究方向。但是，目前仍面临许多尚未解决的问题:什么类型的细胞移植最有效，多少移植细胞最好，什么时间移植效果最佳，移植细胞能否与正常心肌细胞形成同步收缩，是否会发生心律失常，将来是否会形成肿瘤，以及细胞移植后心功能改善的确切机制等，均需进一步研究。
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[作者简介] 孟磊(1969-)，男，江苏沛县人，主治医师，在读硕士研究生。
(东南大学医学院附属徐州医院胸心外科，江苏徐州 221009;东南大学附属中大医院胸心外科，江苏南京 210009)
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