帕金森病大鼠模型激发自体脑内神经干细胞增殖的实验研究
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参见附件(326KB，4页)。
[摘要]目的 研究帕金森病(Parkinson's disease，PD)大鼠激发自体脑内神经干细胞的增殖情况。方法 选用SD大鼠，将6.羟多巴胺(6.OHDA)注入纹状体内制作PD大鼠模型，假手术对照组注入等量生理盐水，于不同时间点处死大鼠。处死前均注射5.溴脱氧尿苷(Brdu)。免疫组织化学方法动态检测Brdu和巢蛋白(Nestin)的表达，以确定脑内增殖细胞和神经前体细胞数量，Brdu.Nestin免疫双标确定脑内神经干细胞的增殖情况。 结果 同正常组、假手术对照组比较，PD大鼠损伤侧海马区、侧脑室室管膜下区和黑质区的Brdu + 细胞、Nestin + 细胞和Brdu + .Nestin + 细胞数在模型成功后的第3、5、7天明显增加，14d后逐渐减少，28d后恢复到正常水平。 结论 6.OHDA纹状体内注射制作PD的模型大鼠能够激活自体神经干细胞增殖。
[关键词] 帕金森病;神经干细胞;增殖;室管膜下区;海马区;黑质区
Experimental study on the proliferation of neural stem cells of rat model of Parkinson's disease
WANG Lei，ZENG Shui-lin，LI Tao，ZHU Jian-bao，LEI Zhi-nian，HAN Yang
(School of Basic Medical Science，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To explore the proliferation of neural stem cells in the rat model of Parkinson's disease.Methods Rat model of Parkinson's disease was made by injecting the6-hydroxydopamine(6.OHDA)into the striatum.The control group was made by injecting saline into the same site.The rats were killed at different time points and their brain were taken out.Before they were killed，the rats were injected Brdu into their abdomen.The dynamic expression of Nestin and Brdu were determined by immunohistochemical staining.Brdu labeling method was used to mark the cells of proliferation.Nestin expression was used to identify neuroprogenitor cells.And they both used to mark the diving neural stem cells.Results Campared with the controls，the number of Nestin-positive cells，Brdu-positive cells，and Brdu-Nestin-positive cells increased strikingly in the hippocampus，subventricular zone and substantia nigra at d3，5，7，then declined at d14and almost reached the normal after28d.Conclusion The rat model of Parkinson's disease by direct injection of6.OHDA in the striatum can stimulates the prolifera-tion of inherent neural stem cells.
Key words:Parkinson's disease;neural stem cells;proliferation;subventricular zone;hippocampus;substantia nigra
帕金森病(Parkinson's disease，PD)是老年人常见的以震颤、肌强直以及运动迟缓为主要临床症状的神经系统变性疾病。本实验通过纹状体内注射6.羟多巴胺(6.OHDA)制作PD大鼠模型，观察其脑内不同区域神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖情况，探讨自体NSCs在PD时自我修复的可能性，为临床PD患者的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 PD大鼠模型的制作[1] 及分组
雄性健康SD大鼠39只，体重200～250g，反复检测以确认其无旋转行为。0.4%的戊巴比妥钠(40mg·kg -1 )腹腔注射麻醉，固定于立体定位仪上，常规消毒、开颅。参照Paxinos，Waston大鼠图谱[2] ，立体定位坐标为两点:第一点AP1 0.2，ML 1 3，DV 1 5.5，用微量注射器向纹状体内缓慢注入6.OHDA(3g·L -1 ，Sigma产品)3μl，留针10min，向上提针0.5至DV4.5，再注入6.OHDA3μl;第二点AP 2 0.7，ML 2 3，DV 2 5.5，注入过程同前。于术后第7天开始，每周1次腹腔内注射阿朴吗啡(APO)(5mg·kg -1 )，记录40min旋转次数，第1周出现偶有旋转(1～2r·min -1 )，第2周明显旋转(4～5r·min -1 )，第3周稳定旋转(7r·min -1或以上者)视为成功模型。PD模型组分为3、5、7、14、28d组，每组6只。正常对照组3只，假手术对照组(注入等量的生理盐水)6只。
1.2 Brdu标记和组织切片
所有实验动物处死前1d腹腔内注射Brdu(每次50mg·kg -1 ，Sigma产品)，每隔4h1次，共3次，常规灌注取前脑和中脑，行冰冻冠状切片，切片厚度6μm。
1.3 免疫组化染色
1.3.1 Brdu标记 50%甲酰胺和柠檬酸钠65℃2h，0.3%H2 O 2 10min，5%HCl37℃30min，0.1mol·L-1 硼酸10min，0.1%胰酶37℃15min，10%羊血清孵育37℃15min，加小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体(1∶500稀释，Sigma产品)4℃过夜，加生物素化二抗(LAB vision)37℃30min，加过氧化物酶标记的链霉卵白素(LAB vi-sion)37℃30min。以上每步之间经0.01mol·L -1 PBS冲洗3次，每次5min，DAB显色。
1.3.2 Nestin标记 0.3%H 2 O 2 10min，10%羊血清封闭15min。加小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体(1∶500稀释，Chemical产品)4℃过夜。加生物素化二抗(北京中山产品)37℃30min，加过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃30min，0.01mol·L -1 PBS冲洗3次，每次5min，DAB显色。
1.3.3 Brdu + .Nestin+ 双标 先用SAP法标记Brdu + 细胞，后用SP法标记Nestin + 细胞，方法同前。
1.4 统计学处理 在每只大鼠海马区、侧脑室室管膜下区(subven-tricular zone，SVZ)及黑质区随机选取4张脑组织片，在200倍光镜下选取3个视野分别计数Brdu + ，Nestin + 及Brdu + .Nestin + 细胞数，并照相。结果以ˉx±s表示，所有数据采用SAS统计软件进行方差分析。
2 结 果
2.1 免疫组化染色
光镜下见Brdu+ 的细胞大多数呈圆形、椭圆形，部分呈梭形，少数呈多边形、不规则形态。胞核深染呈深黄褐色。Nestin+ 的细胞大部分呈梭形或椭圆形，可见长的突起，少数呈多边形或不规则形态。胞质深染呈黄褐色，胞核不着色(图1～3)。Brdu + .Nestin + 细胞形态大多数为圆形、椭圆形、梭形，少数为多边形或不规则形态。镜下可见大多数阳性细胞大小中等，胞核深染呈紫黑色，胞质呈黄褐色。具体数量见表(1、2、3)。3种标记细胞主要集中分布于海马颗粒层、侧脑室SVZ区的背外侧角、外侧壁前部和黑质的致密部。
图1 PD模型成功7d后SVZ区阳性细胞 ×200 (略)
图2 PD模型成功7d后黑质区阳性细胞 ×200 (略)
图3 PD模型成功7d后海马区阳性细胞 ×200(略)
3 讨论
中枢神经系统内存在具有不断更新和分化潜能的NSCs已经成为共识。本实验选用慢性PD模型[1] 研究其脑内NSCs增殖的情况，探讨其在PD病变中的作用。许多研究表明，Brdu能够标记具有增殖活性的细胞，巢蛋白(Nestin)是神经前体细胞或NSCs特征性的生物学标记。由于其它因素如手术创伤等也可以引起脑内细胞的增殖(如炎性细胞)，所以本实验用Brdu + .Nestin + 双标阳性细胞来确定增殖的NSCs，以区别于非NSCs如胶质细胞等。
表1 海马区Brdu + 、Nestin + 、Brdu + .Nestin + 细胞(略)
表2 侧脑室SVZ区Brdu + 、Nestin + 、Brdu + .Nestin+ 细胞(略)
表3 黑质区Brdu+ 、Nestin+ 、Brdu+ .Nestin+ 细胞(略)
本实验观察到:在正常鼠脑中，海马区、侧脑室SVZ区及黑质区仅存在少量Brdu + 、Nestin + 、Brdu + .Nestin + 细胞。PD模型成功后3、5、7d，3个区域的Brdu + 、Nestin + 、Brdu + .Nestin + 细胞大量增加，14d后逐渐减少，但仍高于正常水平，28d后恢复到正常水平。海马区、侧脑室SVZ区及黑质区之间3种标记细胞相比较，海马区和侧脑室SVZ区的标记细胞数量较多，其中侧脑室SVZ区略多于海马区，但两者之间无显著性差异;黑质区的标记细胞明显少于以上两区。在损伤对侧3种阳性细胞也明显增加，但细胞数量明显少于损伤一侧。结果表明:(1)海马区及侧脑室SVZ区存在大量“静止”的NSCs(进一步印证了上述区域为干细胞库的理论);(2)6.OHDA使多巴胺能神经元变性坏死，这一病理因素激发脑内静止的NSCs增殖;(3)黑质区激活的NSCs明显少于上述两区域。并且我们也观察到第2周后上述3个区域NSCs数量明显减少:一方面说明干细胞在不同时程内激活的数量不同，PD模型成功后第1周为激活的高峰期，这与其他学者[3] 研究脑损伤后NSCs的增殖时程基本吻合;另一方面可能与激活的NSCs的迁移和进一步分化有关。有研究[4] 发现，多巴胺能神经元受损后，纹状体的NSCs可分化为胶质细胞。
现有的研究表明，激发NSCs原位增殖的机制可能为:(1)兴奋性氨基酸。在研究脑缺血模型时，Cui等[5] 发现兴奋性氨基酸释放增加，抑制了其受体的激活，促进DNA的合成，使细胞数量增加。PD模型时纹状体内的谷胺酸水平也是升高的，提示兴奋性氨基酸途径在激活NSCs中的重要作用。(2)神经营养因子。现在神经营养因子已被认为是NSCs生长和分化中的重要影响因素。例如，在碱性成纤维生长因子(FGF.2)体外实验中证实其可以促进NSCs的增殖与分化;在脑损伤过程中，发现有FGF.2在细胞内合成的增加，同时其受体表达水平也上调[6] 。(3)在基因调控方面。由于脑内微环境的变化引起Notch基因的激活，使得NSCs增殖(脑损伤时Notch1表达上调)，而Notch基因的活性被抑制时，促进NSCs的分化。这说明Notch信号通路在NSCs的增殖分化过程中的重要性[7] 。总之，NSCs的增殖和分化受控于高度精密和高度协调的网络系统，是多种因素共同作用的结果。
中枢神经系统的NSCs及其临床应用已经成为神经领域研究的热点。但关于PD大鼠模型NSCs增殖的研究鲜有报道。本实验表明，PD模型大鼠可以激活 自身的NSCs，NSCs参与了PD的损伤修复过程。但是激活的细胞数量相对较少(特别是在黑质区)，其最终转化为多巴胺能神经元的细胞数量更是有限。故原位激活的NSCs对PD的治疗作用很不明显。目前，研究者通常采用脑内注射神经营养因子[8] 或进行NSCs体外扩增[9] ，再植入脑内的方法来增加NSCs的数量，但其在功能修复方面的研究结论并不一致。因此，NSCs真正走向临床应用还需要做更深入的研究。
[参考文献]
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[9]SAWAMOTO K，NAKAO N，KAKISHITAK，et al.Generation of dopaminergic neurons in the adult brain from mesencephalic precur-sor cells labled with a nestin-GFP transgene[J].Neurosci，2001，21(11):3895.3903.
[基金项目] 江苏省自然科学基金资助项目(BK2002056)
[作者简介] 王磊(1975-)，男，山东滕县人，助教，在读硕士研究生。
[通讯作者] 曾水林(1954-)，男，安徽安庆人，副教授，硕士生导师。
(东南大学基础医学院解剖与组胚学系，江苏南京 210009)
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