C－erbB-2基因在人肺腺癌细胞表达与药物治疗关系的研究
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[摘要]目的 观察紫杉醇、阿霉素和α.干扰素对不同C-erbB-2表达水平的人肺腺癌细胞系增殖能力的影响，探讨C-erbB-2基因和抗癌药物敏感性的关系。 方法 采用免疫组化方法检测C-erbB-2基因在肺癌细胞株(SPC.A.1、LTEP.α.2和A549)中的表达，观察紫杉醇、阿霉素及α.干扰素干预前后3株肺腺癌细胞系中C-erbB-2基因表达率的变化;采用四氮唑盐(MTT)比色法检测抗癌药物对人肺腺癌细胞体外增殖能力的影响，计算相应IC 50 值;应用集落形成试验检测药物对肺腺癌细胞集落形成能力的影响;结合流式细胞术定量分析药物干预前后各细胞系DNA含量的变化。 结果 SPC.A.1、LTEP.α.2和A5493株肺腺癌细胞系均有不同水平C-erbB-2基因的表达。紫杉醇对低表达C-erbB-2基因的SPC.A.1肺腺癌细胞系的抗增殖作用明显强于高表达C-erbB-2基因的A549和LTEP.α.2肺腺癌细胞系，阿霉素对具有不同C-erbB-2表达水平的3株人肺腺癌细胞系均较敏感，α.干扰素对3株肺腺癌细胞均有一定的抑制作用，但较弱。在SPC.A.1细胞株应用阿霉素和紫杉醇后、LTEP.α.2细胞株应用阿霉素后，其C-erbB-2基因的表达率明显减低，但A549肺腺癌细胞系C-erbB-2表达率的变化无统计学差异。阿霉素和紫杉醇治疗后SPC.A.1和LTEP.α.2肺腺癌细胞系的G2 .M期百分率明显升高，而A549肺腺癌细胞系表现为S期的百分率升高明显，α.干扰素对3株肺腺癌细胞系的细胞周期影响不大。 结论 化疗耐药可能与C-erbB-2基因的高表达有关，C-erbB-2基因的检测可作为非小细胞肺癌患者选择个体化治疗方案的指标。
[关键词] 肺腺癌细胞株;C-erbB-2基因;紫杉醇;阿霉素;干扰素
The study on the relationship between expression of C-erbB-2 oncogene in non-small cell lung cancer and anticarcinogens treatment
ZHU Xiao-li，LIN Yong，TANG Jian-ying，ZHANG Zu-yi
(Department of Respiratory Medicine，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To explore the effect of paclitaxel，doxorubicin and interferon-αon the multiplication capacity of human lung adenocarcinoma cell strain with different expression of C-erbB-2and the relationship between the expression of C-erbB-2and the sensitivity of anticancer medicines.Methods SABC immunohistochemical method was applied to detect C-erbB-2oncogene expression in SPC.A.1，LTEP.α.2and A549cell lines.The cyto-toxity of lung adenocarcinoma in vitro was examined by MTT method.The mitogenic capacity was detected by colo-ny-forming assay.The cell cycle status was determined by flow cytometry.Results There were expressions of C-erbB-2of different level in the three cell lines.The effect of doxorubicin on the three cell lines was higher than that of paclitaxel and doxorubicin.The effect of paclitaxel in SPC.A.1cell line was significantly higher than that of A459and LTEP.α.2cell lines.The restrain action of IFN.αon the three cell lines was less.The expression of C-erbB-2was markedly decreased in SPC.A.1cell line treated with paclitaxel or doxorubicin and in LTEP.α.2cell line treated with doxorubicin.The changes in the others were no significance.The percentages of G 2 -M phase in SPC.A.1and LTEP.α.2cell lines treated with paclitaxel or doxorubicin were significantly increased.In contrast，the per-centage of S phase in A549was increased.The IFN.αhad no noted effects on cell cycle status among the three cell lines.Conclusions The expression of C-erbB-2may reduce the sensitivity of tumor cells to anticancer drugs.The detection of C-erbB-2may be helpful to select therapy project for patients with NSCLC.
Key words:lung adenocarcinoma cell lines;C-erbB-2oncogene;paclitaxel;doxorubicin;interferon-α
非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌75%左右，而腺癌是NSCLC的主要组织学类型之一。分子生物学的研究进展表明，在肿瘤的形成过程中包括多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。C-erbB-2基因(源于基因组DNA)又称为HER.2基因(源于CDNA文库)，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，即p185蛋白(p185neu)。该基因的变异方式主要是基因扩增和RNA及蛋白质的过度表达。本研究通过免疫组化方法检测C-erbB-2基因在肺腺癌细胞中的表达，观察紫杉醇、阿霉素和α.干扰素对不同C-erbB-2表达水平的人肺腺癌细胞系增殖能力的影响，探讨C-erbB-2基因和抗癌药物敏感性的关系，为肺腺癌患者治疗方案的选择提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
SPC.A.1及LTEP.α.2人肺腺癌细胞购自中国科学院上海生化研究所，A549人肺腺癌细胞由我校生物研究所提供。3株均为低分化的人肺腺癌细胞系。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化法 采用链霉亲和素.生物素.过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化方法进行分析。3个肺腺癌细胞系分别接种于25ml培养瓶中常规培养，24h后消化成单细胞悬液，涂片、室温晾干，纯丙酮室温固定20～30min。以小鼠p185蛋白的单克隆抗体作为第一抗体，稀释度为1∶200，生物素化山羊抗小鼠IgG作为第二抗体，稀释度为1∶400，同时用已知阳性表达片作为阳性对照(由博士德生物工程有限公司提供)，以0.01mol·L-1 PBS代替一抗作为阴性对照。细胞系阳性率的计算方法:显微镜下随机选取每张染色片的3个10×40高倍视野(细胞总数大于100个)观察，光镜下阳性细胞的细胞膜染色呈棕黄色，计算阳性细胞占总计数细胞的百分率[1] 。
1.2.2 四氮唑盐(MTT)比色法 设对照组(加各细胞系单细胞悬液200μl)和实验组(各细胞系单细胞悬液100μl+不同浓度的不同药物100μl)。实验组又分为紫杉醇组、阿霉素组和α.干扰素组，每组再分为5个浓度梯度，即Ⅰ组分别给予终浓度为5×10-9 mol·L -1 的紫杉醇、阿霉素和终浓度为50U·ml -1 的α.干扰素;Ⅱ组为5×10 -8 mol·L -1 的紫杉醇、阿霉素和100U·ml -1 的α.干扰素;Ⅲ组为5×10 -7 mol·L -1 的紫杉醇、阿霉素和200U·ml -1 的α.干扰素;Ⅳ组为5×10 -6 mol·L -1 的紫杉醇、阿霉素和500U·ml -1 的α.干扰素;Ⅴ组为5×10 -5 mol·L -1 的紫杉醇、阿霉素和1000U·ml -1 的α.干扰素。实验设3个复孔，重复3次。
取对数生长期的A549、SPC.A.1和LTEP.α.2细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×10 5 ml -1 ，接种于96孔板，每孔加入单细胞悬液100μl。分别于24h及72h后于不同的细胞孔中加入不同浓度的不同药物100μl，加药后继续培养72h，然后每孔加入10μl MTT液(5mg·ml -1 )，继续培养4h，吸去上清液。每孔加入DMSO150μl，使MTT还原产物完全溶解，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定每孔吸光度(A)值。
对于MTT结果进行如下处理，即各药浓度对各细胞系的抑制率按下列公式计算:肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度值.对照组吸光度值)×100%。然后根据Berkson Logit法[2] 计算各药对各细胞系的半数抑制浓度(IC 50 )。具体步骤如下:(1)将药物浓度(D)作对数转换，抑制率(P)作Logit转换，Xi =LogD i (i=1，2，……n)，Y i =LogitP i =Log[P i .(100-P i )](i=1，2，……n)。然后对(X i ，Y i )(i=1，2，……n)作直线回归，得直线方程:Y=A+BX。(2)根据下列公式计算IC 50 值，IC P =Log -1 {Log[P.(100-P)-A].B}。
1.2.3 集落形成实验 将处于对数生长期的A549、SPC.A.1和LTEP.α.2细胞系分别制成单细胞悬液，实验组用含不同药物的培养基稀释(药物终浓度为:紫杉醇5×10 -8 mol·L -1 ，阿霉素5×10 -9 mol·L-1 ，α.干扰素100U·ml -1 )，对照组用常规培养基稀释，接种至6孔培养板中，每孔100个细胞。送细胞培养箱中静止培养10d，显微镜下计数集落数。实验重复2次。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期分布 将肺癌细胞分别接种于25ml培养瓶中，密度为SPC.A.1每瓶1.5×10 6 个细胞，LTEP.α.2每瓶1×10 6 个细胞，A549每瓶1.5×10 6 个细胞。培养48h后予实验组加药，各药终浓度分别为:紫杉醇5×10 -8 mol·L -1 ，阿霉素5×10 -9 mol·L -1 ，干扰素100U·ml -1 。加药24h后消化成单细胞悬液，加入冷PBS震荡后以1500r·min -1 离心5min，弃上清液，加入1%Triton-X.100摇匀后静置10min，离心5min。弃上清液后加入0.01%RNA酶消化10min后离心5min。弃上清液后加入0.005%碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色15min，用300目丝网过滤后即可上机收集分析。Cellquest软件采集样本后，用Modfit LT软件进行分析，计算出各周期的DNA相对含量和百分数。
1.3 统计学方法
数据用ˉx±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 人肺腺癌细胞系C-erbB-2基因表达率
经检测，SPC.A.1、LTEP.α.2、A549人肺腺癌细胞C-erbB-2基因表达率分别为32%、56%、69.5%。
2.2 药物对不同C-erbB-2表达水平人肺腺癌细胞集落形成能力的影响见表1。
表1 经各干预因素作用的人肺腺癌细胞的集落数(略)
紫杉醇对SPC.A.1肺癌细胞系集落形成能力的抑制作用明显高于LTEP.α.2和A549肺癌细胞系;阿霉素对SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺癌细胞系均有较强的抑制作用;而干扰素对SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺癌细胞系均有一定抑制作用，但较弱。
2.3 药物对不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞系增殖作用的影响见表2。
紫杉醇对低表达C-erbB-2的SPC.A.1肺癌细胞系 的IC50 值明显低于高表达C-erbB-2的A549和LTEP.α.2肺癌细胞系;阿霉素对低表达C-erbB-2的SPC.A.1肺癌细胞系的IC 50 值略低于高表达C-erbB-2的A549和LTEP.α.2肺癌细胞系，但差异不明显;干扰素对A549和LTEP.α.2肺癌细胞系的体外抑制作用小于50%，在SPC.A.1肺癌细胞系，其IC 50 值为380U·ml -1 。
表2 药物在3株肺腺癌细胞系中的IC 50 值(略)
2.4 药物对人肺腺癌细胞系C-erbB-2基因表达率的影响
见表3。
表3 各组在药物干预前后各细胞系C-erbB-2的表达率(略)
紫杉醇作用组SPC.A.1肺腺癌细胞系的C-erbB-2表达率较对照组下降明显(P<0.05)，而LTEP.α.2和A549肺腺癌细胞系C-erbB-2表达率的变化无显著差异(P>0.05);阿霉素作用组SPC.A.1和LTEP.α.2肺腺癌细胞C-erbB-2的表达率均较对照组下降(均P<0.05)，尤以SPC.A.1明显;而A549肺腺癌细胞系C-erbB-2表达率的变化无显著差异(P>0.05);α.干扰素作用组SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺腺癌细胞系的C-erbB-2的表达均有所下降，但无统计学意义(均P>0.05)。
2.5 药物对人肺腺癌细胞细胞周期动力学的影响见表4。
表4 药物干预前后人肺腺癌细胞系细胞周期状况(略)
紫杉醇治疗后SPC.A.1和LTEP.α.2肺腺癌细胞系的G 2 .M期百分率明显升高;而A549肺腺癌细胞系表现为S期的百分率升高明显;100U·ml-1 α.干扰素对SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺癌细胞系G0 .G1 期的影响不大。
3 讨论
C-erbB-2基因表达与肺癌的生物学关系及其对肺癌诊断、治疗的价值是当前探讨的课题。近年来的研究提示，非小细胞肺癌中存在HER.2.neu的过表达，有报道[3，4] ，p185在NSCLC中表达可高达50%以上。p185蛋白在细胞膜表面的过量表达可导致p185异常激活，通过下游的信号转导，最终导致细胞的增殖乃至癌变[5] 。p185高表达提示死亡危险性增大，是癌症进展的标志，表明临床预后较差[4，6] 。它的表达可能减低抗癌药物的敏感性[7] 。本研究中3株肺腺癌细胞均有不同程度的C-erbB-2基因表达，表明C-erbB-2基因在非小细胞肺癌，特别是肺腺癌的病理过程中占有十分重要的地位。
本实验采用体外培养具有不同C-erbB-2表达水平的SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺腺癌细胞系，并选取3个当前在肺癌的治疗中较常用的、作用机制不同的抗癌药或抗癌辅助药，即周期特异性药紫杉醇、周期非特异性药阿霉素及生物调节剂α.干扰素，通过MTT比色法、集落形成实验，研究其对肿瘤细胞生长、增殖的影响，通过细胞免疫组化法和流式细胞术，研究C-erbB-2基因表达状况与抗癌药敏感性的关系，对抗癌药的耐药机制进行初步探讨。结果显示，紫杉醇对低表达C-erbB-2基因的SPC.A.1肺腺癌细胞系的抑制作用明显强于高表达C-erbB-2基因的A549和LTEP.α.2肺腺癌细胞系，提示高表达C-erbB-2的肺腺癌细胞株对包括紫杉醇在内的化疗药不敏感;阿霉素对具有不同C-erbB-2表达水平的3株肺腺癌细胞SPC.A.1、LTEP.α.2及A549均有较明显的抑制作用，提示C-erbB-2高表达的肺腺癌细胞株并不抗拒包括阿霉素在内的抗癌药;α.干扰素对具有不同表达C-erbB-2水平的3株肺腺癌细胞SPC.A.1、LTEP.α.2及A549均有一定的抑制作用，但相对较弱，推测其可能是通过直接抑制肿瘤细胞的生长而发挥作用。
本实验细胞免疫组化结果显示，在紫杉醇作用下，SPC.A.1肺腺癌细胞系的C-erbB-2表达率较对照组(未用药)明显下降(P<0.05)，而LTEP.α.2和A549肺 腺癌细胞系C-erbB-2表达率的变化无统计学差异(P>0.05)，这与细胞增殖抑制实验结果及IC 50 值相一致;在阿霉素作用下，SPC.A.1和LTEP.α.2肺腺癌细胞C-erbB-2的表达率均下降(与对照组相比，P<0.05)，尤以SPC.A.1明显，但A549肺腺癌细胞系C-erbB-2表达率的变化无统计学差异(P>0.05);在α.干扰素作用组，SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺腺癌细胞系的C-erbB-2的表达均有所下降，但无统计学意义(P>0.05)。提示C-erbB-2在肺腺癌耐药机制中可能有一定的作用。此外，本实验流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，阿霉素和紫杉醇治疗后SPC.A.1和LTEP.α.2肺腺癌细胞系的G 2 .M期百分率明显升高;而A549肺腺癌细胞系表现为S期的百分率明显升高;α.干扰素对SPC.A.1、LTEP.α.2和A549肺癌细胞系的细胞周期影响不大。上述结果提示给予紫杉醇、阿霉素干预后，低表达及中度表达C-erbB-2的SPC.A.1和LTEP.α.2肺腺癌细胞不能通过G 2 检查点致使其不能完成细胞周期，因而对上述化疗药敏感;而化疗药紫杉醇和阿霉素允许高表达C-erbB-2的A549肺腺癌细胞进入S期，提示暴露于上述化疗药的这些细胞仍能持续增殖。这些结果与细胞增殖抑制实验结果一致，即高表达C-erbB-2的A549肺腺癌细胞存活率高，抑制率低。本实验阿霉素对高表达C-erbB-2的A549肺腺癌细胞仍然有效，则可能是通过诱导凋亡实现有效抗癌的。我们的结果显示，其凋亡率为29.75%。α.干扰素的作用机制尚有待进一步研究。因此，我们可以假设在肺腺癌细胞，C-erbB-2的高表达可能对预测化疗药的反应性有一定的意义。尽管我们尚不能证实，但我们的结果可以部分解释肺癌化疗耐药现象，因为C-erbB-2在肺腺癌中的表达也是很常见的，将C-erbB-2的表达水平作为一个预后因素可能有助于对肺腺癌患者的处理，可作为非小细胞肺癌患者选择个体化治疗方案的一个指标。
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[作者简介]朱晓莉 (1962-)，女，江苏丹阳人，副主任医师。
(东南大学附属中大医院呼吸科，江苏南京 210009)
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