基质金属蛋白酶与自体移植静脉再狭窄
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[摘要] 自体移植静脉再狭窄严重影响冠状动脉旁路移植术远期疗效，基质金属蛋白酶(MMP)是一族细胞外基质降解酶，近年来发现它们在自体移植静脉再狭窄过程中发挥了重要作用。自体静脉移植后MMPs的表达及活性增强，通过影响基质转换及血管壁细胞功能而促进内膜增生，并参与移植静脉收缩性再构。非选择性MMP抑制剂可减轻内膜增生，预防移植静脉再狭窄。
[关键词] 基质金属蛋白酶;静脉移植;内膜增生;再构
Matrix metalloproteinase and autologous vein graft failure
HE Wei，LIU Zhi-yong
(Department of Cardiothoracic Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Failure of coronary artery venous grafts occurs at a substantial rate and has a large impact on the long-term effect of the operation of coronary artery bypass grafting.Matrix metalloproteinases are the family of highly regulated peptidases that are collectively responsible for the degradation of extracellular matrix.In recent years，MMP are thought to play an important role in the process of vein graft failure.Increased MMP expression and activity have been identified after vein grafted into artery system.Through mechanisms that rely on degradation and reorgani-zation of extracellular matrix，MMP contributes to intimal hyperplasia as well as constractive remodeling in the vein graft.Use of nonspecific inhibitors can decrease intimal thickening and seems to prevent vein graft stenosis.
Key words:matrix metalloproteinase;vein graft;intimal hyperplasia;remodeling
冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)是治疗冠心病的重要方法之一。目前自体静脉仍是血管桥的主要来源，但其远期通畅率不高。术后1年10%～15%的静脉桥发生阻塞，此后以每年2%～4%递增，至术后10年，约50%的静脉桥出现严重的再狭窄或阻塞[1] 。内皮细胞脱落及功能不全，各种生长因子、细胞因子的释放，手术机械损伤、血流动力学改变启动移植静脉病变过程。术后早期，内皮损伤、基底膜暴露促进血小板黏附、沉积在损伤部位，分泌凝血因子激活凝血酶原，从而促进局部血栓形成。术后2个月内，血管平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMC)及纤维母细胞表型发生改变，分泌各种功能蛋白质，通过自分泌及旁分泌途径刺激细胞大量增殖并迁移至内膜，合成、分泌细胞外基质，导致内膜增生，过度的增生导致管腔严重狭窄及堵塞，一般认为这是再狭窄的关键。在此基础上，移植静脉更易发生粥样硬化性病变，最终引起临床事件的发生[2] 。与此同时，由于管腔压力的改变移植静脉不断发生血管重构，收缩性重构加重血管的狭窄程度。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一族对细胞外基质成分有特异降解作用的锌依赖性蛋白水解酶，其通过影响细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解和转换，在移植静脉病变发生发展中起重要作用。
1 血管壁基质及金属蛋白酶
血管壁包括内、中、外膜3层结构。内膜由单层内皮细胞衬于基底膜构成，该基底膜主要由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白(lami-nins)、基底膜蛋白多糖(perlecan)组成。由各自基底膜环绕的SMC及ECM形成中膜，ECM成分包括胶原纤维、结构糖蛋白及蛋白多糖(PGs)。外膜主要包括胶原纤维及纤维母细胞。内、外弹力膜将3层分隔。ECM为血管壁的完整性和血管壁细胞正确行使功能提供了结构框架。它们的存在不仅保证了血管壁的弹性和对牵拉的抵抗性，而且还通过与血管壁细胞的相互作用，为细胞传递增殖、迁移、分化和凋亡信号，调节血管壁细胞对生长因子和趋化因子的反应能力，决定血管平滑肌细胞的形态发生和表型状态。正常血管壁ECM代谢非常缓慢，而在某些病理状态，胶原溶解酶及弹性蛋白酶类分泌并激活，ECM转换加速。MMPs在其中发挥了重要作用。MMPs是一类锌原子依赖性内肽酶，迄今发现有20余种，参与血管壁ECM代谢的主要有:胶原酶(MMP.1，由内皮细胞分泌);明胶酶(MMP.2，由血管壁细胞持续表达;MMP9，由巨噬细胞、中性白细胞及诱导的血管壁细胞表达);“弹性蛋白酶”(MMP.7，由血管壁细胞低水平表达);基质溶解素(stromelysins)以及膜型基质金属蛋白酶(membrane-type met-alloproteinases MT.MMPs)[3] 。目前的研究揭示MMP.2、MMP.9与移植静脉病变密切相关。
MMPs蛋白溶解活性受3个水平的调节:第一，基因转录与酶原的分泌;第二，酶原的激活;第三，组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)的调节。MMPs均以酶原的形式分泌，酶原的激活需解离半胱氨酸.Zn2+ 结合并去除前肽，在体内酶原可被纤溶酶、凝血酶、活性氧簇、其它MMPs及MT.MMPs激活。MT.MMPs则由细胞内氟林蛋白酶(furin)激活。所有MMPs活性都受到TIMPs所抑制。生理状态下，血管壁MMPs激活与TIMPs抑制作用为主要调节机制，它们的精确平衡维持ECM代谢于极低水平。
2 移植静脉MMPs.TIMPs表达及活性变化
在CABG手术中，当大隐静脉移植入动脉系统后，静脉桥发生重构，MMPs的表达水平和活性改变在血管壁重构和狭窄的形成进展中为一早发事件。Southgate等[4] 将猪的大隐静脉移植到颈总动脉，模拟CABG手术，经酶谱法检测发现，术后移植静脉MMP.2、MMP.9的分泌及活性明显升高，并呈时间依赖性，MMP.2活性在术后7d达高峰，MMP.9在未手术时不表达，术后2d内表达开始升高，并持续升高到第28天达高峰;同样的变化亦在人大隐静脉离体培养模型中观察到。其它的MMPs包括MMP.1和MMP.3在损伤静脉中的表达也增多[5] 。从大隐静脉内膜增生模型中观察到MMPs活性天然抑制物TIMPs的表达亦增强[6] ，可能作为一种自身保护机制，控制血管壁基质降解，防止过度扩张。
有资料表明，血流动力学改变、损伤、炎症反应、氧化应激均能影响MMPs表达及活性。比较不同压力条件下离体大隐静脉MMPs活性，结果显示:动脉压力下MMPs表达及活性明显增强[7] 。外科手术中静脉桥准备时的机械牵拉及血管壁剪切应力改变都是MMPs活性改变的触发因素[5，8] 。机械因素促进MMPs表达机制比较复杂，包括:(1)机械刺激导致内皮细胞损伤或脱落，血小板、中性白细胞黏附，大量炎性细胞因子、生长因子释放，如血小板生长因子(PDGF)、转化生长因子.β(TGF.β)、白细胞介素.1(IL.1)、肿瘤坏死因子.α(TNF.α)等，早期研究表明，这些细胞因子、生长因子都可上调MMPs的基因表达;(2)还原型辅酶.2(NADPH)氧化产生的活性氧簇(ROS)促进MMPs表达[9] ;(3)机械刺激信号经ECM与SMC细胞黏附分子(inter-grins)、细胞膜受体、G蛋白相互作用传入细胞内，活化内源性酪氨酸激酶(MARP)、蛋白激酶C(PKC)并向核内转位，激活核因子.κB(NF.κB)、活化蛋白(AP.1)，这些转录因子调控MMPs基因的转录水平[10] 。最近研究表明，血管壁压力升高还可通过内皮 素.1(ET.1)、血管紧张素.2促进内皮细胞表达MMPs[11，12] 。
3 MMPs与移植静脉内膜增生
内膜增生是指移植静脉内膜细胞大量增殖，合成、分泌ECM，导致内膜增厚。研究表明，这些细胞主要来源于中膜SMC，外层的纤维母细胞也参与了新生内膜的形成。在移植后8周内，几乎所有静脉都会发生不同程度的内膜增厚，并最终形成粥样硬化导致静脉狭窄或堵塞。SMC向内膜迁移、增殖是这一病理过程的始发事件。然而细胞迁移需突破内弹力膜及其它ECM成分，这一过程需要在蛋白水解酶的协助下完成。MMPs是血管壁主要蛋白酶，静脉移植后其活性呈时间依赖性改变，并与移植静脉内膜增生时程密切相关。利用合成的MMPs抑制剂能明显减轻内膜增生程度及SMC迁移能力[13，14] ，证明MMPs参与了降解血管壁基质，特别是内弹力膜及基底膜，促进中膜SMC向内膜迁移这一过程。体外实验也证明，合成的MMPs广谱抑制剂和MMPs抗体能显著降低SMC对再造基底膜的迁移能力，而过度表达MMP.9则促进SMC在胶原中的迁移力。有学者对人大隐静脉进行培育形成内膜增生模型，免疫组织化学方法显示，中膜有基底膜包绕的SMC由(93±1)%下降至(77±4)%，所有迁移至内膜的SMC周围的基底膜均被降解，而经转染TIMP.1或TIMP.3处理后的大隐静脉，中膜Ⅳ型胶原阳性的SMC比例则明显增多，分别为(94±2)%或(98±2)%，同时迁入内膜的细胞数则显著减少，由此，作者认为SMC迁移必需要依赖细胞周围的基底膜完全降解，原因可能是基底膜是细胞迁移的物理屏障，或是因为细胞迁移的信号被细胞和基质之间相互作用所阻断[15] 。基底膜主要由Ⅳ型胶原构成，为MMP.2、MMP.9的底物。
用基因敲除方法证实，MMP.2通过降解基底膜及内弹力膜促进SMC迁移，而对SMC增殖没有影响[16] 。Cho等[17] 同样利用MMP.9裸鼠进行实验，发现MMP.9基因缺失不但有抗迁移作用，而且还能抗细胞增殖，从而抑制内膜增生。MMP.9抑制细胞增殖的作用机制仍不完全明了，可能的解释有:MMP.9释放与基质结合的细胞因子、生长因子如FGF、VEGF、TGF.β、TNF.α等;MMP.9降解基质，使细胞膜intergrins或受体脱膜(shed-ding)，阻断了细胞之间的相互作用，影响转化信号的传导。
在移植静脉，正是由于MMPs活性增强，MMPs.TIMPs之间的平衡遭受破坏，促进了内膜增生。George等[18] 用猪的大隐静脉转染TIMP.3基因后移植到颈总动脉，术后14、28d，内膜增生程度比对照组分别减少84%及58%。同样，在动脉损伤模型[19] ，转染TIMP.1基因后显著抑制了内膜增生。然而，由于观察时间的限制，这种抑制作用是否具有远期效果还需进一步验证。
4 MMPs与收缩性重构
移植静脉管腔面积的改变不仅取决于内膜增生厚度，亦与血管壁重构有关。CABG术后理想的重构应是移植静脉“动脉化”，即更富有弹性，但实际上所有移植静脉在术后数月内管壁均变得厚而僵硬，成为一纤维化管道[20] 。这种变化是由基质转换，新基质重排、沉积导致血管壁重构所致。移植静脉可发生收缩性重构或扩张性重构。收缩性重构进一步减少了管腔的面积引起狭窄，其细胞及分子学机制现仍不清楚，多数学者认为与伤口愈合过程相似。基质金属蛋白酶通过调节基质代谢及细胞功能参与形成收缩性重构。Sierevogel等[21] 认为，血管损伤后外膜厚度增加，且与收缩性重构程度呈正相关，MMPs抑制剂可以通过减少血管外膜基质沉积及厚度，从而减轻收缩性重构。血管损伤后早期MMPs活性提高，不仅通过促进胶原转换，而且通过细胞膜受体的溶解、细胞黏附分子的激活以及炎症反应的调节等作用促进收缩性重构。利用基因敲除大鼠进行实验，发现MMP.9缺失可导致损伤血管壁外膜胶原沉积比对照组增加，有趣的是血管收缩性重构反而减轻。体外实验证实，这种作用是由影响了血管壁细胞重排、收缩ECM的能力所致[22] 。细胞利用MMP.9而不是MMP.2作为细胞.基质之间相互作用的桥梁，影响ECM重排的功能在最近的实验也得到证实[23] 。尽管这些实验证实了MMPs可促进血管壁收缩性重构，然而要确定由哪些特定的MMP参与此作用及其分子机制仍需进一步研究。
5 结束语
大隐静脉移植到动脉系统后，MMPs.TIMPs平衡被破坏，MMPs活性增强，ECM代谢加速，进而引起内膜增生、血管再构，最终形成移植静脉狭窄。因此，调节MMPs活性或维持MMPs.TIMPs平衡将为预防移植静脉狭窄提供有效途径。动物实验显示，合成的非选择性MMPs抑制剂可预防内膜增生及收缩性重构，但存在一定的副作用。因此，进一步研究MMPs在移植静脉再狭窄形成中作用的分子学机制，寻找高选择性、高亲和性的MMPs抑制剂，并确立特定的干预时间将成为一项有意义的工作。
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[作者简介] 何伟(1973-)，男，安徽望江人，住院医师，在读硕士研究生。
(东南大学附属中大医院心胸外科，江苏南京 210009)
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