羊膜移植对碱烧伤小鼠角膜基质金属蛋白酶表达的影响及其意义
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[摘要]目的 探讨羊膜移植对急性碱烧伤小鼠角膜基质金属蛋白酶(MMP.2，MMP.9)的表达影响及其意义。 方法 将40只昆明小鼠随机分为实验组和对照组，采用1mol·L-1 氢氧化钠溶液烧伤小鼠角膜，建立炎症性角膜碱烧伤动物模型;对实验组小鼠右眼角膜行羊膜移植术，对照组不行羊膜移植。然后在羊膜移植术后2、7、14、21d处死动物，用免疫组织化学染色方法和计算机图像分析系统检测小鼠角膜烧伤后基质金属蛋白酶在角膜中的分布及其平均吸光度值。 结果 在对照组，角膜中MMP.2、MMP.9在第2天出现表达，第7天达高峰，以后逐渐降低。实验组各时间点MMP.2及MMP.9表达均低于对照组。 结论 羊膜移植术可抑制角膜细胞及浸润的炎症细胞产生基质金属蛋白酶，从而抑制和延迟碱烧伤后角膜溶解的发生和发展。
[关键词] 碱烧伤;角膜溶解;基质金属蛋白酶;羊膜移植;小鼠
Expression of matrix metalloproteinase in alkali-burned mouse model with
amniotic membrane transplantation
LI Fang，XING Yi-qiao，YANG Yan-ning，HE Tao，WU Li，CHEN Bin
(Department of Ophthalmology，Renming Hospital of Wuhan University，Wuhan430060，China)
Abstract:Objective To study the expression and role of matrix metalloproteinase-2(MMP.2)and matrix metalloproteinase-9(MMP.9)in mice with cornea alkali burn after amniotic membrane transplantation.Methods Forty KM mice were divided into two groups and their corneas were burned with alkali followed by amniotic mem-brane transplantation(AMT)was performed in experimental group.At different time points(2，7，14，21days)after AMT，the expressions of MMP.2and MMP.9in cornea were detected immunohistochemically，and the results were analyzed by computer medical image analysis system.Results In control group，MMP.2and MMP.9were ex-pressed in the epithelial cells，stroma cells and exudated inflammatory cells.The level of MMP.2and MMP.9were found elevated on the2nd day，peaked on the7th day，dropped gradually afterwards.At the same point，the levels of MMP.2and MMP.9in AMT group were greatly lower than the control group.Conclusion Immediate interven-tion with amniotic membrane transplantation for acute alkali burns promotes wound healing and prevents cornea from melting by inhibiting the production of matrix metalloproteinase in epithelium and inflammatory cells.
Key words:alkali burn;cornea solve;matrix metalloproteinase;amniotic membrane transplantation;mice
角膜碱烧伤是一种常见的眼病，可导致角膜溶解、 新生血管形成及溃疡穿孔等严重病理改变，使患者视力明显下降。近年来，羊膜移植治疗眼表面疾病已成为一个热点，并取得了很大成就[1] 。已有研究显示基质金属蛋白酶(MMPs)在角膜溶解、角膜新生血管形成及角膜溃疡穿孔等角膜病变中起着重要作用[2，3] 。本研究将小鼠角膜碱烧伤后行羊膜移植，观察角膜中基质金属蛋白酶(MMP.2，MMP.9)的表达变化，初步探讨羊膜移植和延迟碱烧伤后角膜溶解发生和发展的机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
兔抗小鼠MMP.2、MMP.9多克隆抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG及SP试剂盒Histostain TM.Plus Kits，均购自北京中山生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物
昆明小鼠(中国预防科学院动物中心提供)40只，雌雄不限，体重20～25g，经检查无任何眼病。
1.2.2 羊膜的准备
通过产前血清学检查，选择梅毒、HIV、HBV、HCV均为阴性的产妇。无菌条件下将羊膜自顺利剖宫产的胎盘上取下，用含有50mg·L-1 青霉素、50mg·L -1 链霉素、100mg·L-1 新霉素、2.5mg·L-1 二性霉素B的PBS液冲洗，钝性剥离绒毛膜并尽量去除羊膜的海绵层组织。将羊膜上皮面朝上平铺于无菌的带有0.45μm大小微孔的硝酸纤维素滤纸上，然后将附有羊膜的纸片剪成4cm×4cm大小的方块，置于含DMEM与甘油为1∶1的保存液的无菌瓶内，于-80℃冻存。术前将羊膜于低温下解冻后使用。
1.2.3 烧伤模型的制备与分组
采用1%地卡因表面麻醉，充分保留眼前段表面，将统一规格直径为2.0mm的单层圆形滤纸片浸于1mol·L-1 氢氧化钠溶液中，使其达饱和状态，吸水纸吸除多余液体，将滤纸片置于暴露的昆明小鼠右眼角膜中央，烧灼10s，移去滤纸后立即用10ml生理盐水冲洗结膜囊1min。随机将40只烧伤小鼠分为羊膜移植组和对照组，每组20只，根据碱烧伤后2、7、14、21d随机分为4亚组，每亚组5只，24h内完成手术。
1.2.4 手术方法
采用1%戊巴妥钠(45mg·kg-1 )腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉后，用8.0缝线行上下睑牵引，充分暴露角膜。将备好的羊膜片上皮面朝上平铺 于眼表面，其边缘超出角膜缘2mm，用10.0缝线间断缝合4针，固定于角膜缘，使羊膜紧贴于角膜创面。用8.0缝线将上下睑缘缝合1针。
1.3 标本获取与处理
1.3.1 免疫组织化学染色
分别在各时间点用颈椎脱臼法处死实验组及对照组小鼠，迅速摘除右眼，中性福尔马林固定，常规逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，3μm连续切片，常规脱蜡，捞片，60℃烤片，过夜后行免疫组织化学染色。阴性对照以PBS代替兔抗小鼠MMP.2及MMP.9多克隆抗体，方法与步骤同上。
1.3.2 MMP.2、MMP.9表达观察
光镜下观察免疫组织化学染色切片，抗MMP.2抗体、抗MMP.9抗体染色阳性的细胞表现为胞质程度不同、基本均匀的棕黄色粗大颗粒反应，反之则为染色阴性。
1.3.3 免疫组织化学计算机图像分析
采用HPIAS2000型计算机医学图像分析系统(由武汉大学医学院病理计算分析中心提供)对上述各组组织切片进行分析。方法如下:实验组和对照组每亚组取5张切片，每张切片在角膜部位随机取3～5个视野(400倍)作图像分析，计算5张切片的平均吸光度，作为该组阳性细胞的平均吸光度，用ˉx±s表示。实验数据经计算机SPSS10.0软件进行两样本t检验。
2 结 果
2.1 免疫组织化学染色结果
免疫组织化学染色显示对照组小鼠MMP.2阳性染色主要见于角膜上皮细胞、基质层及血管内皮细胞。MMP.9阳性染色所在部位与MMP.2基本相似。碱烧伤后2d，角膜上皮细胞MMP.2、MMP.9表达增多。碱烧伤后7d，上述部位表达明显增强，基质层可见大量炎性细胞浸润、新生血管形成，且血管内皮细胞可见表达(图1)。碱烧伤后14～21d阳性染色略为减轻。实验组各时间点MMP.2及MMP.9阳性染色都较对照组显著减弱(图2)。阴性对照采用PBS代替羊抗小鼠MMP.2一抗，碱烧伤后7d角膜无棕黄色颗粒(图3)。
2.2 免疫组织化学计算机图像分析结果
计算机图像分析系统测量实验组和对照组MMP.2、MMP.9阳性细胞的平均吸光度。其各时段均值变化情况见表1。表1 小鼠碱烧伤后不同时间角膜中MMP.2及MMP.9(略)
羊膜移植后7d，新生血管、基质层炎性细胞明显减少，角膜上皮细胞、基底膜和新生血管内皮细胞MMP.2阳性表达明显减弱 SP×400
3 讨 论
眼部化学烧伤是一种常见的眼部病变。一旦眼表面组织受损，会导致患者视力受到极大的影响。近年来，羊膜移植在眼表疾病中的应用越来越广泛。一些学者在临床上用羊膜移植治疗角膜热烧伤或化学烧伤取得了明显疗效，改善了患者的视力[4] 。本研究通过观察羊膜移植对小鼠角膜碱烧伤后角膜中基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响，初步探讨其抑制和延迟碱烧伤后角膜溶解发生和发展的机制。
MMPs是一族能降解细胞外间质及基底膜成分、在结构上具有极大同源性的锌离子依赖的蛋白裂解酶家族。至今已确认有20余种不同的MMP存在。MMPs不仅在胚胎发育、组织塑形中起着重要作用，还具有重要的病理意义。MMPs表达增多和酶活性增强参与了许多疾病的发生。MMPs根据作用的底物不同可分为胶原酶、明胶酶、基质溶素和膜型金属蛋白酶4大类。MMP.2、MMP.9属于MMPs家族成员中的明胶酶类，二者性质相似，均以非活性酶原形式分泌，能降解明胶、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和弹性蛋白[5] 。有研究表明[6，7] ，在角膜溶解及其他各种角膜病理状态下，多种MMP被激活，其表达及活性均有不同程度的升高并参与角膜基质胶原的降解，从而造成角膜溃疡和角膜溶解。各种原因所造成的MMP.2及MMP.9活性过高与角膜组织的破坏溶解密切相关。另一方面，MMP.2及MMP.9在基底膜上能够表达它的蛋白水解活性，特异性地降解基底膜Ⅳ型胶原，从而对细胞外基质进行改建，促进新生血管的形成。
作者通过实验发现，羊膜移植组在各时间点MMPs的表达相对于对照组明显降低，提示羊膜具有抑制MMPs在角膜上皮及多形核白细胞(PMN)中表达的作用。一方面羊膜自身包含有多种蛋白酶抑制剂，如α1 .抗胰蛋白酶、α2 .纤溶酶抑制剂、TIMPs等，可抑制对PMN有强趋化作用并对角膜基质产生破坏作用的胶原酶物质，从而在碱烧伤后通过抑制基底膜的降解，降低上皮缺损的发生率和溃疡的形成[1，8] 。另一方面羊膜通过抑制PMN浸润角膜基质，减少胶原酶和血纤维蛋白溶酶等的产生，发挥保护作用。故对碱烧伤角膜早期行羊膜移植可有效地抑制溃疡的形成和促进修复过程，减少角膜血管化、角膜穿孔等并发症的发生。
[参考文献]
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[8]KIM J S，KIM J C，NA B K，et al.Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn[J].Exp Eye Res，2000，70:329. 337.
(武汉大学人民医院眼科，湖北武汉 430060)
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