内质网与细胞凋亡
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[摘要] 内质网(endoplasmic reticulum，ER)广泛存在于真核细胞中，是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所，是调节细胞的应激反应及细胞钙水平的场所，也是胆固醇、类固醇及许多脂质合成的场所。ER应激在细胞凋亡中起重要作用，现就ER应激在细胞中的作用、ER应激与Ca2+ 水平的调节及与相关凋亡蛋白之间的关系等方面进行综述。
[关键词] 内质网;细胞凋亡;应激
Relationship of endoplasmic reticulum with apoptosis
FANG Xi-min，CHEN Ming-zhen
(Institution of Pediatrics，Affiliated Hospital，Guangdong Medical College，Zhanjiang，Guangdong，524001，China)
Abstract:Endoplasmic reticulum(ER)extensively exists in eukaryocytes，where protein synthesis，and fold，recruitment are regulated after protein synthesis，the stress action of cell and calcium level in cell are adjusted，as well as cholesterol，steroids and most of lipid are synthesized.ER stress plays an important role in the cell apopto-sis.This article reviews the role of ER stress，the regulation of ER stress and the level of Ca2+ and the relation to apoptotic proteins.
Key words:endoplasmic reticulum;apoptosis;stress
细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(pro-grammed cell death，PCD)，在维持机体正常的生理平衡中起重要作用。调节细胞凋亡的途径目前主要有3种:线粒体途径、死亡受体途径和内质网(ER)途径。ER主要通过它的应激而调节细胞的死亡程序。在凋亡过程中，ER途径与线粒体途径相似，和Bcl.2家族成员及caspases关系密切。
1 ER的应激作用
ER首先停留于分泌的通路上[1] ，在那里，伴侣分子(chaperone)辅助的多肽折叠与修饰使蛋白获得成熟的转变。当有害刺激使ER正确折叠蛋白的能力被削弱或压制时，应激信号能通过ER膜传递到细胞核中，继而引起一系列特定的靶基因转录上调和蛋白质翻译水平下调，一种高度保守的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)信号传导通路被激活[2] 。UPR通过阻止普通蛋白的合成，同时上调ER残存伴侣蛋白或其它通路的调节成分，这些伴侣蛋白介导的能量代谢确保ER蛋白高效率地折叠，为细胞生存提供一个较好的环境。但是如果损伤太大而致内环境稳定不能恢复，UPR最终激发凋亡。这些作用既能为受损细胞提供修复机会，又能最大限度清除过度损伤的细胞，为维护机体的生理平衡和内环境的稳定起到重要作用。
1.1 维护细胞内环境的稳定
哺乳类动物细胞有3个ER跨膜蛋白(Irel、ATF6、PEPK)，它们均对腔内未折叠蛋白的聚集起作用[3] 。它们调节基本亮氨酸拉链的质和量，通过相互作用对不同的UPR产生不同的应答，如果这种反应不能充分地减少ER应激，细胞可能发生凋亡或坏死。Irel是Ⅰ型丝氨酸.苏氨酸激酶，有一个特殊的RNA酶激活位点，当其活化RNA酶后能编码HAC1，HAC1经剪切、翻译，产生一个强的活性因子，后者激活UPR元素上游的UPR诱导基因，引起UPR。Irel核内区的C端能产生一个活化的bZIP转录因子，刺激ER伴侣蛋白的基因转录[4] 。PEPK正常情况下通过N端区域与伴侣蛋白Bip联系而保持一种失活状态。在ER应激时，Bip(结合在未折叠蛋白上的)和其失去联系而解离，Irel、PEPK进行同源寡聚化，刺激丝氨酸.苏氨酸蛋白激酶区域内的反.自身磷酸化，PEPK能翻译起始因子eIF2α，在蛋白折叠条件被减弱时eIF2α能终止翻译或阻止新合成的蛋白持续进入ER。ATF6(activation tran-scription factor6)是另一种调节蛋白，能结合应激反应元件。ATF6在ER中进行蛋白水解分裂，释放它的活性bZIP转录因子到细胞核，并激活XBP1增强子，使XBP1转录增加，导致UPR的活化。所有这一切都能维护细胞内环境的稳定，使细胞更好地生存。
1.2 ER应激引起细胞凋亡的机制
实验表明，如果ER损伤太严重或在一定时间内稳态未恢复，凋亡反应即会发生。ER应激导致细胞死亡可能存在以下机制。
1.2.1 线粒体.Apaf.1依赖途径
线粒体是ER应激诱导凋亡通路的重要元件，因为(1)ER应激导致线粒体释放细胞色素C(cytochrome c，cyt.c)并丧失线粒体的跨膜电位;(2)Bcl.2.Bcl.xl阻止ER应激诱导凋亡;(3)Bax-.-、Bak-.-及MEFs能抵抗TG.、TN.和BAF诱导凋亡。此外，URP可能上调别的单一BH.3结构蛋白，类似于单一BH.3基因对P53介导的应激反应[5] 。ER应激诱导cyt.c释放依赖于c.Abl的苏氨酸激酶，因为c.Abl-.-鼠纤维母细胞能抵抗A23187.、BAF.及TN.诱导的cyt.c释放与细胞凋亡。哪一种c.Abl在这一位点起作用，其机制可能与JNK激酶有关，这些激酶在ER应激时可被Irel所招募并活化，如UPR能上调CHOP.GADD153(一种核转录因子，可抑制Bcl.2的启动)，通过减少Bcl.2蛋白表达而提高线粒体对促凋亡因子的敏感性 [6] ，导致cyt.c由线粒体膜间隙(the intermembrane space，IMS)释放到胞浆。在dATP.ATP存在下，cyt.c首先与胞浆中的凋亡蛋白激活因子1(apoptotic protease activating factor，Apaf.1)结合，形成多聚复合体，后者充分聚集于胞质中并导致其自动活化成caspases.9，然后启动级联反应，继续活化下游的caspases如caspase.3和caspase.7。整个过程为一正反 馈，活化的caspases能对其底物进行特异的切割，导致DNA片段化，促使细胞发生凋亡[7] 。
1.2.2 caspase.12的活化途径
Caspase.12与其它的caspases一样以无活性的酶原形式存在(由1个调节区和2个催化的P20和P10亚单位组成)。但是，与其它caspases不一样的是caspase.12对诱发ER应激时的攻击非常特异，而且不能被别的死亡刺激蛋白水解而活化。caspase.12定位于ER胞浆表面，其活化的机制未明。鼠神经胶质细胞对缺氧与缺糖所产生的ER应激研究表明，caspase.12是被钙激活蛋白酶裂解。在体外钙激活蛋白酶能裂解T132和K158细胞的caspase.12，从催化亚单位释放促结构(prodomain)并增加酶的活性。这表明，caspase-12的活性与Irel信号传导有关。ER应激诱导TRAF2从procaspase.12释放，释放的TRAF2使procaspase.12在ER膜上聚集并导致其活化，活化的caspase.12能活化caspase.9，后者再活化caspase.3，从而启动凋亡。Zong等发现[8] :caspase.12裂解过程在Bax.1细胞中无效，caspase.12的裂解能被ER激发的Bak表达所诱导。且caspase.12前体能被其下游的caspases(如caspase.7)所裂解。
1.2.3 促凋亡编码基因的激活
ER应激导致促凋亡编码基因的激活，如活化UPR受体Irel、ATF6、PEPK，然后导致Chop.GADD153的活化[9] ，Chop是一个小的核蛋白，属转录因子C.EBP家族成员，当其高表达能影响ER蛋白的折叠功能，并引起细胞周期停滞及DNA损伤，使细胞发生凋亡。
2 通过ER Ca
2+ 信号调节凋亡ER Ca2+ 释放主要经两条通道:三磷酸肌醇受体(IP3R)通道和阿理诺碱受体(RyR)家族通道[10] 。也可能存在别的Ca2+ 释放通道。在许多凋亡中都有ER Ca2+ 的释放，IP3R介导的信号通过调节Ca2+ 水平而直接调节细胞死亡机制。缺乏1型IP3R(IP3R1)的Jurkat细胞并不增加[Ca2+ ]c对地塞米松的反应。但是死亡信号(如地塞米松、离子射线、T细胞受体等)引起IP3R活化仍然不完全清楚。
Ca2+ 信号参与细胞死亡通路，很大程度上是由时-空模式及ER Ca2+ 释放的强度所决定。IP3R.RyR.依赖的Ca2+ 增加可通过以下几种机制影响凋亡:(1)钙依赖钙激活蛋白酶的活化而激活caspases;(2)钙激活蛋白酶裂解Bax而增加其促凋亡的活性;(3)钙激活蛋白酶还可通过caspases而执行凋亡。Ca2+ 信号能导致Bad活化，Ca2+ 依赖的活化转录因子MEF2导致Nur77.TR3上调，后者能结合线粒体导致cyt.c的释放。相反Ca2+ 在ER与线粒体之间的优势转运可使线粒体对促凋亡Bcl.2家族成员的敏感性增加，这可能与Ca2+ 能诱导线粒体膜渗透转运孔的开放有关。
3 ER和Bcl.2
家族蛋白Bcl.2家族成员能定位于不同细胞器膜上，调节caspases酶的活性。根据其结构和功能的不同可将Bcl.2家族成员分为3组[11] ，第1组包括Bcl.2、Bcl.xl和Bcl.w，含有4个高度保守的BH和1个疏水性.C末端结构域(HCD)，它们具有抗凋亡的特性;第2组是单一BH3结构的Bcl.2家族成员，在细胞接受凋亡刺激时能增加线粒体外膜的通透性;第3组是包含了除BH4外的所有结构域，也能增加膜通透性，具有促凋亡的活性。Bcl.2家族的3组成员定位于内质网膜上并影响ER的稳态(可能通过膜通透性改变)。例如ER Ca2+ 的释放，可以直接激活死亡效应或影响线粒体对死亡信号的敏感性;再次，ER成员蛋白通过作用于Bcl.2家族成员或者改变ER对Ca2+ 的反应来影响凋亡。ER应激与相应凋亡的研究表明，ER和线粒体一样能直接启动caspases引起细胞凋亡。
3.1 抗凋亡成员
研究表明，Bcl.2可调节ER Ca2+ 稳态，而且有抗凋亡作用。但是由于检测的细胞不同，其机制是有争议的。例如，有报道Bcl.2在细胞凋亡中能增加ER的Ca2+ 含量而抑制其释放。也有报道Bcl.2过度表达能减少ER的Ca2+ 稳态而增加ER膜对Ca2+ 的渗透性;Ca2+ 信号的改变使得细胞对凋亡的敏感性减弱[12] 。根据后一理论，减少ER Ca2+ 的量能抑制细胞凋亡，而增加ER Ca2+ 能使细胞对凋亡敏感。可能由于改变ER的Ca2+ 能影响IP3R\RyR的Ca2+ 电流强度，使线粒体在凋亡过程中对BH.3依赖的cyt-c释放敏感[13] 。也有报道Bcl.2能增加线粒体对Ca2+ 的贮存能力。这说明定位在ER和线粒体的Bcl.2能通过降低IP3R\ RyR释放游离Ca2+ 数量及增加线粒体对Ca2+ 的负荷来阻止两者凋亡的串话(crosstalk)。
3.2 促凋亡成员Bax和Bak
促凋亡多区域的Bcl.2家族成员也可能定位于某些细胞的ER上，并在这些位置诱导凋亡[14] 。例如，人PC3细胞的Bax和Bak(定位于线粒体和ER上)过度表达时，能诱导caspases非依赖地清空ER Ca2+ 库，而增加线粒体Ca2+ 负荷。Ca2+ 摄取抑制剂能阻止Bax.Bck诱导的增加线粒体Ca2+ 含量及cyt-c释放和凋亡。Bax 裸鼠能抵抗癌基因抑活药诱导ER Ca2+ 释放、线粒体对Ca2+ 的摄取及cyt-c的释放。所有这些都可被Bax的再表达所克服。敲除Bax、Bak双基因的细胞能减少Ca2+ 从ER释放并减少线粒体对Ca2+ 的摄取[15] 。Bax、Bak能导致ER Ca2+ 的释放，使caspase-12裂解而活化，后者诱导细胞凋亡。总之，Bax、Bak能在线粒体和ER的Ca2+ 依赖通路中起着“串通”的双重作用。
3.3 单一BH3结构的成员
单一BH3结构成员也存在于ER上，例如，位于ER上的Bik [16] ，在对DNA损伤和癌基因应激中，其mRNA和蛋白被P53诱导。且ER的Bik又能诱导cyt-c释放，这种释放与线粒体和caspases无关，因为用Bik处理的H1299细胞(加入了caspases抑制剂)分离出来的S9在体外能引起cyt-c的释放。Bik.Bcl.2异二聚体可在ER表面交叉连接，高比率的Bik∶Bcl.2可作用于ER，导致Ca2+ 释放及cyt-c从线粒体释放、细胞凋亡，但是定位于ER的Bcl.2能抑制Bik引起的细胞凋亡，说明Bik在ER的活性受Bcl.2的影响。其它的单一BH3结构如tBid、Bim、Noxa和Puma也有类似的作用。另外，单一BH3结构蛋白还可诱导在ER膜上Bax.Bak的寡聚化并介导调节caspases活性的腔蛋白(luminal protein)释放，从而引起调节凋亡。
4 ER与caspases
Bcl.2调节caspases活性上游或与线粒体通路相平行，在ER膜的Caspase-12活化代表了一个线粒体非依赖的caspases活化机制。另外一种新型的procaspase-8同型体procaspase-8L也象procaspase-12一样，与ER胞浆面相关，但其调节凋亡可能和BAP31复合体有关，BAP31是一种ER独特表达的多态内膜蛋白，其与BAP29相联系，是caspase-8的一个亚态[17] 。在癌基因E1A诱导凋亡的过程中，procaspase-8L能选择性地募集BAP31。随着procaspase-8L在ER的活化，BAP31在Fas死亡受体刺激下能快速地被caspase-8裂解
[18] ，Fas在胞浆膜通过直接募集或者激活procaspase-8，继而caspase-8裂解Bid，产生tBid，诱导Bax.Bak依赖的cyt-c从线粒体释放，并激活下游的caspases而启动凋亡。
总之，ER应激与细胞生存和死亡关系密切，ER应激导致的凋亡受Bcl.2家族及caspases的调节。但ER应激是怎样导致细胞凋亡、怎样受Bcl.2家族及caspas-es调节的确切机制，仍待以后进一步的研究。
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(广东医学院附属医院儿科研究所，广东湛江 524001)
[基金项目] 广东省卫生厅资助项目(A2002501)。
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