人胎胰岛样细胞团体外增殖条件的研究
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参见附件(248KB，3页)。
[摘要]目的 探讨人脐血清(UCS)、生长激素(GH)、烟酰胺(Nic)以及肝细胞生长因子(HGF)等多种因子对人胎胰岛样细胞团(ICCs)体外增殖的作用，为临床胰岛细胞移植提供数据。 方法 取8例水囊引产的胎儿胰腺，胶原酶消化法制备胰岛样细胞团，分别加入UCS、GH、Nic、HGF及小牛血清等多因子组合培养，进行形态学观察，同时放射免疫法测定胰岛素分泌量。 结果 8例胎儿胰腺组织体外培养均见到ICCs的生长和繁殖，培养6d后，UCS+(GH+Nic+HGF)组ICCs获得量显著高于另外三个培养组。二硫腙染色示UCS+(GH+Nic+HGF)组ICCs均为B细胞，其纯度达80%～90%。 结论 UCS、GH、Nic以及HGF共同作用于人胎胰岛细胞的体外培养时具有交互作用，能明显促进B细胞的增殖，显著提高胰岛样细胞团的获得率和胰岛素的分泌量。
[关键词] 胰岛样细胞团;脐血清;生长激素;肝细胞生长因子;烟酰胺;增殖
Studies on proliferative effects of culture additives on human fetal isletlike cell clusters in vitro
XIA Dong，HE Hong-yuan，LEI Zheng-ming，LI Qiu，YAN Lü-nan，Guo Yong
(1.Department of General Surgery，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu610041，China;2.Department of Histology and Embryology，Luzhou Medical College，Luzhou646000，China;3.Hepatobiliary and Pancreatic Laboratory，Luzhou Medical College，Luzhou646000，China)
Abstract:Objective To investigate the effects or interactions of human umbilical cord serum(UCS)，growth hormone(GH)，nicotinamide(Nic)and hepatic cell growth factor(HGF)on the proliferation and insulin content of human fetal isletlike cell clusters(ICCs)in vitro.Methods Eight human fetal pancreatic glands，freshly obtained from legally induced abortions，were briefly exposed to collagenase V.ICCs were cultured in RPMI-1640plus UCS，GH，Nic，HGF and fetal calf serum，the proliferation of ICCs and their insulin content were then estimated.Results In the8consecutively explanted glands，development and proliferation of ICCs were observed.After a6-day culture in the medium，proliferation of ICCs maintained in UCS+(GH+Nic+HGF)was markedly increased compared with explants supplemented with rest culture additives.DTZ-stained ICCs in UCS+(GH+Nic+HGF)suggested that most cell clusters were islet cells(B cells)，and the purity of islets was about80%to90%.Conclu-sions The combined results of this study suggest that human fetal ICCs can be viably maintained in tissue culture media containing UCS+(GH+Nic+HGF)，and these additives promote an abundant proliferation of ICCs contain-ing relatively high insulin content，which may facilitate the in vitro expansion of pancreatic B cells intended for islettransplantation.
Key words:isletlike cell cluster;human umbilical cord serum;growth hormone;hepatic cell growth factor;nicotinamide;proliferation
胰岛细胞来源的匮乏一直困扰着临床胰岛细胞移植的开展。促进人胎儿胰岛B细胞的体外增殖，调节其影响因素来获得足够数量的功能性B细胞，具有重大的理论意义和现实意义[1] 。有报道在人胎胰岛组织体外培养液中添加生长因子可以促进胰岛B细胞的增殖，提高胰岛素的分泌量[2] 。为此，本研究探讨人脐血清(UCS)、生长激素(GH)、烟酰胺(Nic)以及肝细胞生长因子(HGF)等多种因子对人胎胰岛样细胞团(ICCs)在体外增殖和胰岛素分泌的影响，从而为临床胰岛细胞移植提供数据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
8例水囊引产胎儿(胎龄14～32周)由泸州医学院附属医院产科提供。1.2 主要试剂
Ⅴ型胶原酶、RPMI1640培养基、二硫腙(DTZ)、10%小牛血清(FCS)由Sigma公司提供，其它常规试剂均为进口或国产分析纯。
1.3 脐血清的制备
按王立茹 [3] 法取自足月妊娠健康产妇。
1.4 ICCs的制备和培养
经水囊引产的死胎8例，娩出后2h内无菌取胰，以D.Hanks液漂洗，清除胰腺外组织，剪成1mm3 大小的组织块，加入Ⅴ型胶原酶彻底消化后收集所需的ICCs，加入RPMI1640培养液4ml，再分成4份加入4个分别盛有5ml RPMI1640培养液(11.1mmol·L-1 葡萄糖)的培养瓶中，分别添加不同的试剂或试剂组合构成不同实验组。
Ⅰ组:加入10%FCS1ml;Ⅱ组:加入GH(100μg·L-1 )+HGF(25μg·L-1 )+Nic(10mmol·L-1 )的因子组合1ml;Ⅲ组:加入10%(vol.vol)UCS1ml;Ⅳ组:加入GH(100μg·L-1 )+HGF(25μg·L-1 )+Nic(10mmol·L-1 )的因子组合共0.5ml，同时加入10%UCS0.5ml。将4组细胞配制成所需密度(细胞密度应>105 个·ml-1 )，置于37℃、体积分数为5%的CO2 培养箱中培养。24h后转板，间日调换培养液继续培养。分别于培养的第2、4、6天留取标本，作相应检测。
1.5 形态学检查
在细胞培养过程中，定期在倒置相差显微镜下观 察细胞生长情况。台盼蓝计数细胞存活率，DTZ染色鉴定胰岛细胞纯度，同时行超微结构观察。
1.6 生物学活性鉴定
分别于第2、4、6天收集培养液的上清液，放射免疫法测定胰岛素分泌量。在培养的第6天末，将各孔收集的细胞用Hanks液洗净，经反复冻融破碎，置于酸化乙醇中连续抽提，取上清液检测胰岛素含量。
1.7 统计学方法
实验数据采用ˉx±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 形态学观察
体外培养24h后转板，胰岛细胞很快铺开生长，4～5d即形成分布均匀的细胞单层，ICCs的增殖亦到达一个平台期。台盼蓝染色计数细胞存活率各组均达到90%以上。于倒置相差显微镜下观察，可见大量大小不等的散在细胞和小细胞团，细胞团多呈圆形、椭圆形，也有少数呈不规则形的，包浆颗粒丰富，体积较小，排列紧密，细胞核及核仁明显。添加了UCS的两组ICCs生长良好，几乎未见成纤维细胞生长;而其余两组的ICCs略大，形态不规则，可见成纤维细胞生长。用DTZ染色后，染成猩红色的细胞团即为典型胰岛或ICCs。4组的超微结构观察未见特殊差异，部分培养板中可见少量无分泌颗粒、细胞器较少的细胞。镜下计数Ⅳ组的DTZ阳性细胞团的纯度达到80%～90%，Ⅱ、Ⅲ组的DTZ阳性细胞团的纯度为70%～75%，而Ⅰ组的纯度不到65%。2.2 胰岛功能检测胰岛素分泌量随培养时间呈逐渐下降趋势，培养第6天各组胰岛素分泌量分别为第2天的45%、50%、60%和75%。培养第2天、第4天及第6天的胰岛素分泌量，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组比较，差异均有显著性(P<0.05)。体外培养第6天末，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组相比，ICCs获得量与胰岛素含量的均值均较高，ICCs的获得量分别是Ⅰ组的2倍、4倍和5倍，差异均有显著性(P<0.05)，其中尤以Ⅳ组的作用为甚。直线相关分析显示4组的ICCs获得量与胰岛素含量呈显著的正相关关系(r值分别为0.49、0.55、0.51、0.70，均P<0.05)。见表1。 表1 各组ICCs获得量和培养不同时间胰岛素分泌量的比较(略)
3 讨 论
近年来，将死亡胎儿的胰腺组织用于胰岛细胞移植治疗糖尿病已经取得了可喜的进展。相对于成人胰岛供体，胎儿胰岛对低温低氧的耐受力强、免疫原性低、胰岛组织丰富、含有干细胞，移植后可保持正常的生长增殖能力，较少引起移植物抗宿主病，因此成为理想的供体组织[4] 。
本实验采用DTZ来鉴定胰岛B细胞纯度，可靠且简便易行[5] 。DTZ为螯合指示剂，可与铅、铜、锌等螯合，人的胰岛B细胞含锌，DTZ染色呈猩红色，而其它胰岛细胞不着色，故DTZ对胰岛B细胞呈特异性染色。实验中于倒置相差显微镜下观察，可见大量大小不等的散在细胞和小细胞团，细胞团多呈圆形、椭圆形，DTZ染色后呈猩红色的细胞团即为典型胰岛或ICCs。
通过电镜、DTZ染色等形态学研究发现，人胎胰岛体外培养出现最多的是分泌胰岛素的B细胞，此外还有少量的外分泌细胞以及成纤维细胞。现在认为，胰 腺的内、外分泌部有着共同的干细胞来源[6] 。在胎儿期，胰岛的体积超过全胰的1/3;出生后，外分泌部的增长开始加快，胰岛则相对减少。陈曦等[7] 报道，随体外培养天数的增加，培养孔内的胰岛细胞数量亦增多，但上清液中淀粉酶含量却成比例下降，考虑系培养期间外分泌部细胞逐渐死亡造成，同时提示新增生的细胞可能是内分泌细胞或者某些具有分化潜能的未分化细胞，Amory等[8] 认为后者可能是干细胞(pancreatic stem cells)，亦或是前胰岛细胞(proislet cells)。我们在实验中也观察到少量无分泌颗粒、细胞器较少的细胞，推测极可能是胰腺干细胞。作为未分化的多潜能细胞，胰腺干细胞在一定情况下可以再生成为新的胰岛细胞。
研究表明，GH、HGF和Nic可促进人胎胰岛B细胞的生长增殖和功能成熟，在与人血清的共同作用下效果更为显著[9] 。GH能促进ICCs的形成、胰岛素的释放以及有丝分裂活性的增加;Nic对人胎胰岛细胞的分化和成熟起诱导作用;HGF可增加胰岛素含量以及ICCs中B细胞的比例，加入GH后作用更明显。在人胎胰岛细胞体外培养中最常用的是FCS，其次是人血清(HS)，而UCS极少使用。Sandler等[10] 对10%FCS和10%HS在人胎胰岛细胞体外培养中的作用进行比较后发现，HS作用下的ICCs获得量是FCS组的7倍，其DNA含量更高，胰岛素的合成和分泌量亦显著增高，细胞更适宜进行移植。Clayton等[11] 报道，在培养基中加入HS或UCS可维持胎胰胰岛包膜及其功能的完整性，抑制胰岛附着，使胰岛保持自由泳动达2～5个月;如以FCS代替，则可致胰岛附着、包膜破裂，最终造成功能早期终止。
UCS含有蛋白质、糖、激素等多种活性物质，可以为人胎胰岛B细胞体外增殖提供必需的生长调节因子，补充必要的营养成分和生长基质成分。通过我们的实验发现，UCS能够刺激人胎胰ICCs的体外增殖，促进胰岛素的合成和释放，与GH、HGF和Nic具有交互作用。可能与UCS源于人体，作用与人的正常生理相一致，含有胰岛素、HGF和IGF-Ⅰ等多种促生长因子的比例更适宜于人胰岛细胞的生长和增殖等因素有关[11，12] 。且UCS来源广泛，花费极低，脐血采集对母亲和新生儿没有任何不良影响。但UCS真正有作用的促生长因子是什么，用于胰岛细胞移植是否能继续保持其功能，值得进一步探讨。
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[12]XIA D，HE H Y，LEI Z M，et al.Effects of human umbilical cord serum on proliferation and insulin content of human fetal islet-like cell clusters[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2004，3:144.148.
[作者简介] 夏冬(1975-)，男，四川南充人，住院医师，在读博士研究生。
(1.四川大学华西医院普外科，四川成都 610041;2.泸州医学院组织胚胎学教研室，四川泸州 646000;3.泸州医学院肝胆胰研究室，四川泸州 646000)
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