替米沙坦对肾性高血压心肌纤维化及结缔组织生长因子的影响
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[摘要]目的 探讨替米沙坦对肾血管性高血压心肌纤维化及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。 方法 建立二肾一夹肾血管性高血压(2K1C.RH)大鼠模型，将实验大鼠随机分为3组:假手术组、高血压组及替米沙坦治疗组。术后4周末开始以替米沙坦30mg·kg -1 ·d-1 灌胃，共8周。测量大鼠收缩压、胶原容积分数(CVF)、血管周围胶原面积(PV-CA)及CTGF、转化生长因子.β1 (TGF.β1 )的表达。 结果 与假手术组大鼠相比，高血压组的收缩压、CVF及PVCA显著增加(P<0.01)，CTGF、TGF.β1 表达上调(P<0.01);替米沙坦组与高血压组相比，心肌组织中CVF、PVCA、CTGF及TGF.β1 的表达明显降低(P<0.05)。 结论 替米沙坦可抑制高血压心肌纤维化，其机制可能与下调CTGF的表达有关。
[关键词] 替米沙坦;肾血管性高血压;心肌纤维化;结缔组织生长因子;转化生长因子.β
Effects of telmisartan on myocardial fibrosis and expression of connective
tissue growth factor in renovascular hypertensive rats
CHEN Zhi-long，HA Dai-wen，WANG Yan-wu
(1.Department of Cardiology，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan430071，China;2.Department of Pathology，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan430071，China)
Abstract:Objective To investigate the effects of telmisartan on myocardial fibrosis and connective tissue growth factor(CTGF)in renovascular hypertensive(RH)rats.Methods RH models were established in24rats.rats were randomly divided into sham group，RH group and telmisartan group.Four weeks after，rats in telmisartan group were administered telmisartan30mg·kg-1 ·d-1 for8weeks.Systolic blood pressure(SBP)was measured.Collagen volume fraction(CVF)，perivascular collagen area(PVCA)，CTGF and TGF.β1 expression in left ventricu-lar tissue were calculated.Results Compared with sham group，The SBP，CVF，PVCA，CTGF and TGF.β1 ex-pression increased markedly in RH group(P<0.01).Compared with the RH group，CVF，PVCA，CTGF and TGF.β1 expression decreased in RH group(P<0.05).Conclusions Telmisartan could inhibit the development of myocardial fibrosis in renovascular hypertensive rats.It was probably related to the decrease expression of cardiacal CTGF.Key words:telmisartan;renovascular hypertension;myocardial fibrosis;connective tissue growth factor;transforming growth factor-β1 (Modern Medical Journal，2005，33:101.103)
心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)在形态和生化上主要表现为胶原沉积增多，各型胶原比例失调。无论何种原因引起的心脏损害，只要病变持续和病程慢性化，最终可致MF，MF也是高血压左室重构的主要表现之一。MF的消退可恢复实质和间质之间的平衡，使心脏硬度和心功能得到改善。因此，逆转MF是心力衰竭的防治目标之一。在影响MF的细胞因子中，转化生长因子.β1 (TGF.β1 )被证实与细胞外基质(ECM)积聚关系密切，是公认的器官纤维化治疗靶标。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是新近报道的CCN家族成员之一。近年人们发现CFGF作为TGF.β1 的下游介质，其异常表达在MF过程中起重要作用[1] 。AT1 受体拮抗剂为拮抗高活性RAS状态致病理性损坏的常用药物。本实验旨在探讨AT1 受体拮抗剂替米沙坦抑制高血压大鼠MF的作用及可能机制。
1 对象与方法
1.1 动物模型及分组
健康雄性Wistar大鼠(由湖北省医科院提供)24只，体重180～220g，随机分为3组(n=8):假手术组、高血压组、替米沙坦组。采用二肾一夹(2K1C)经典造模法[2] 复制肾血管性高血压大鼠模型。用3%戊巴比妥钠(30mg·kg-1 )腹腔注射麻醉，行腹正中切口切开腹壁，游离左肾动脉并用内径为0.2mm银夹钳夹，使左肾动脉部分狭窄，右侧肾动脉不触及。假手术组方法相同，但不安置银夹。术后每2周测血压1次，凡术后4周尾动脉收缩压高于20kPa者确定为高血压形成。替米沙坦组于2K1C术后第4周末开始给予替米沙坦片(勃林格殷格翰国际公司提供)30mg·kg-1 ·d-1 灌胃，连续8周，其余两组给予等量自来水灌胃。给药8周后测量大鼠尾动脉收缩压，处死大鼠进行其它指标的检测。1.2 指标检测
1.2.1 收缩压(SBP)测定
大鼠于40℃预热15min后，用RBP1型大鼠尾压心率测定仪(中日友好临床医学研究所研制)测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压。1.2.2 胶原形态定性及定量分析 取左室中段横截面心肌组织，按常规固定，制片(4μm)后行胶原特异性染色—VG纤维染色。在VG染色下，心肌细胞、红细胞呈黄色，胶原呈红色。采用HPIAS.2000型图像分析系统，测量心肌组织胶原容积积分(CVF)和心肌血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积.总面积，PV-CA=小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。在光镜下，任选取4个视野，以视野中所有胶原面积之和(不包括血管周围胶原面积)除以心肌纤维和结缔组织面积总和，得出CVF。每张心肌切片任选取4个壁内 小动脉，计算PVCA。
1.2.3 CTGF、TGF.β1 免疫组织化学染色方法(SP法) 取石蜡切片常规脱蜡入水，3%H
2 O2 处理20min封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤，微波处理20min，再加10%正常羊血清，置室温20min后加第一抗体(浓缩型兔抗CTGF、TGF.β1 购自博士德生物技术有限公司，工作浓度分别为1∶100和1∶150)，置室温2h并于4℃过夜，PBS洗涤，加生物素标记羊抗兔IgG室温20min，PBS洗后加辣根酶标记的链霉卵白素工作液室温20min，PBS洗涤，DAB显色液显色，苏木素复染。同时磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组织化学图像分析经标准灰度校正后随机取5个视野(×200倍)，测定阳性细胞的吸光度及面积(μm2 )，以两者乘积表示组织中该抗原相对含量，乘积越大表示抗原含量越高。
1.3 统计学方法
所有数据以ˉx±s表示，采用单因素方差分析和q检验。应用SPSS统计软件进行统计学处理，P<0.05示差异有显著性。
2 结 果
2.1 各组血压及CVF、PVCA值的比较
高血压组的收缩压显著高于假手术组(P<0.01);替米沙坦组收缩压明显下降，与高血压组相比差异有极显著性(P<0.01)。高血压组的心脏间质和血管周围胶原显著增加，并可见瘢痕灶，肌间隙中胶原增多，呈栅栏状紧裹心肌细胞。高血压组CVF和PV-CA值均显著高于假手术组(P<0.01)。与高血压组相比，替米沙坦组心脏间质和血管周围胶原均减少，未见明显瘢痕灶，其CVF和PVCA明显降低(P<0.05)。见表1。表1 各组大鼠的SBP、CVF及PVCA值的比较(略)注:1mmHg=0.133kPa;与高血压组比较，
2.2 心肌组织中CTGF、TGF.β1 的表达
假手术组动脉壁及间质仅少量CTGF、TGF.β1 表达;高血压组大鼠左心室心肌组织中CTGF、TGF.β1 表达明显上调，主要表现为动脉中膜、瘢痕灶棕黄色阳性细胞表达增加，与假手术组相比差异有极显著性(P<0.01)。在用替米沙坦治疗8周后，心肌组织中CTGF、TGF.β1 表达下降，与高血压组比较差异具有显著性(P<0.05)，见表2。表2 各组大鼠心肌CTGF、TGF.β1 的相对含量(略)
3 讨 论
本实验成功构建肾血管性高血压模型，制造高血压靶器官的损害即心肌纤维化，发现CTGF、TGF.β1 蛋白在肾血管性高血压心肌纤维化中异常表达。肾血管性高血压大鼠经替米沙坦治疗后，心肌纤维化减轻的同时心脏内CTGF、TGF.β1 表达也明显下调。心脏纤维化的机制尚未完全阐明，多数学者认为其致病因素是综合性的，循环和局部的神经内分泌因素的作用可能更重要。这些神经内分泌因子包括血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、儿茶酚胺、内皮素、TGF.β1 、CTGF等，其中以AngⅡ对MF的形成影响最大。AngⅡ作为生长因子类促进剂，其促纤维化形成的一个途径就是调节TGF.β1 、CTGF在心血管中的表达 [3，4] 。结缔组织生长因子是新近报道的CCN家族成员之一，为一富含半胱氨酸的具有致纤维化作用的多肽蛋白。生理情况下，机体组织细胞可有基础量CTGF分泌;病理情况下，它与皮肤瘢痕、动脉粥样硬化、器官纤维化、创伤修复等疾病密切相关。Chen等[1] 研究发现急性心肌梗死大鼠在梗死后2～16周左心室中TGF.β1 和CTGF mRNA的表达显著增高，并与纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的mRNA水平的伴随升高密切相关。在转基因鼠(拥有人类肾素及血管紧张素原基因)研究中，Piet等[3] 发现CTGF表达水平增高并伴有TGF.β1 、Ⅰ型胶原基因和Ⅲ型胶原基因表达增高。TGF.β1 是CTGF的强诱导剂，在CTGF的启动子157～145核苷酸序列存在一个新的TGF.β1 应答元件，故认为TGF.β1 诱发CTGF表达 增高，TGF.β1 的生物学作用部分由CTGF介导。体外实验发现，CTGF的拮抗剂可抑制TGF.β1 诱导的致纤维化作用[5] ，CTGF现被视为是抗纤维化治疗的新靶点。
AngⅡ可通过促进TGF.β1 表达而间接或直接促进CTGF表达。体外实验发现，使鼠成纤维细胞过度表达的AT1 受体可诱使CTGF表达增高[6] 。AT1 受体是AngⅡ产生心血管作用的靶位，选择性阻断AT1 受体可使肾素血管紧张素系统受到充分抑制。替米沙坦系AT1 受体拮抗剂，肾血管性高血压大鼠经替米沙坦治疗后，心肌纤维化减轻的同时心脏内CTGF表达也明显下调，证实AT1 受体拮抗剂替米沙坦减轻心肌纤维化的效应与降低心肌内CTGF表达有关。其减少CT-GF表达机制可能为:(1)通过选择性地与AT1 受体结合而直接阻断了CTGF增多;(2)通过选择性地与AT1 受体结合阻断了TGF.β1 的表达增多，从而间接影响了CTGF的表达。
[参考文献]
[1]CHEN M，LAM A，ABRAHAM J A，et al.CTGF expression is in-duced by TGF.beta in carbiac fibroblasts and cardiac myocytes:a potential role in heart fibrosis[J].J Mol Cell Cardiol，2000，32:1805.1819.
[2]彭韬，李庆平.粉防己碱对肾性高血压大鼠小血管重构的影响[J].南京医科大学学报，2003，23:8.10.
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[4]MONICA R，OSCAR L，LUIS M，etal.Connective tissue growth factor is a mediator of angiotensinⅡ.induced fibrosis[J].Circuca-tion，2003，108:1499.1505.
[5]DUNCAN M R，FRAZIER K S，ABRAMSON S.Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor beta induced col-lagen synthesis;down regulation by camp[J].FASEB，1999，13:1774.1786.
[6]YU J，PRADO G N，TAYLOR L，et al.Global chimeric exchanges within the intracellular face of the bradykinin B2receptor with cor-responding angiotensinⅡtype Ia receptor regions:generation of ful-ly functional hybrids showing characteristic singaling of the AT1a receptor[J].J Cell Biochemistry，2002，85:809.819.
[作者简介] 陈智龙(1975-)，男，湖北黄石人，主治医师，医学硕士。
(1.武汉大学中南医院心内科，湖北武汉 430071;2.武汉大学中南医院病理科，湖北武汉 430071)
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