乙型肝炎病毒前Ｃ区Ａ83变异株ＤＮＡ定量检测及临床意义
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参见附件(186KB，3页)。
[摘要]目的 定量检测乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清中HBV DNA前C区A83变异株DNA水平，并探讨其临床意义。 方法 应用扩增抗拒突变分析系统(ARMS)，检测HBV DNA前C区A83位点突变，引入内参照系统，对突变株DNA作定量检测。 结果 有HBV DNA前C区A83位点突变的58例慢性肝病患者血清中病毒变异株DNA水平(对数值)为(5.37±0.60)copies·ml-1 ，13例无症状病毒携带者(ASC)血清中病毒变异株DNA水平(对数值)为(4.02±0.51)copies·ml-1 ，两者比较，t=7.54，P<0.001，差异有高度显著性;10例献血员血清中未检测到A83病毒变异株。 结论 HBV DNA前C区A83变异株水平与临床病情相关，定量检测可以快速准确地反映变异株在体内的复制状态，对临床诊断、治疗和预后判断具有重要意义。
[关键词] 乙型肝炎病毒;变异株;定量分析
Quantitative analysis of HBV DNA precore A83mutations and clinical
significance among patients with hepatitis B
LUO Li-bo，WANG Yong-zhong，WU Guo-xiang，MA Chun-ming，ZHOU Guo-ping，ZHOU Sheng-sheng.
(Changzhou Third People's Hospital，Changzhou213001，China)
Abstract:Objective To detect the hepatitis B virus precore A83mutations levels and study clinical signifi-cance in different patients with hepatitis B.Methods Amplification refactory mutations system(ARMS)were used to detect A83mutations，and referenced standard were used in system.Results Fifty-eight chronic liverish pa-tients and13ASC persons were detected，in which HBV DNA levels with A83mutations(log10 )were(5.37±0.60)，(4.02±0.51)copies·ml
-1 respectively.Ten blood donors were not found HBV A83mutations.Conclusion A83mutations in the hepatitis B virus precore gene may be associated with the chronic liverish and quantative analy-sis of A83mutations could reflect the conditions of hepatitis B virus directly，which is helpful to diagnoses，therapy and prognosis judgment.
Key words:hepatitis B virus;A83mutations;quantity analysis
乙型肝炎病毒前C区A83变异是乙型肝炎病毒 (HBV)基因组中最常见的变异，有报道显示A83变异与HBV感染后肝炎慢性化和病情加重有关，应用扩增抗拒突变系统(ARMS)可以快速检测患者血清中是否存在HBV前C区A83变异[1] ，引入内参照系统，可以实现对变异株的定量检测，现将结果报道如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
58例慢性肝病患者均为本院住院患者，所有患者血清HBsAg、HBV DNA、HBV前C区A83变异株定性检测均阳性。其中慢性乙型肝炎32例，乙肝肝硬化15例，乙肝肝癌11例，诊断标准符合2000年第10次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案[2] 。
1.2 主要仪器和试剂
PE9600型基因扩增仪(美国ABI公司)、Labsystem MK3型酶标仪、Beckman低温高速离心机，主要试剂及内参照系统由上海浩源生物工程有限公司提供。
1.3 HBV DNA提取及PCR扩增
取50μl患者血清加入到50μl病毒裂解液中，混匀后，37℃保温1h，然后加入100μl样品中和液，混匀后取5μl加入到PCR反应体系中，50℃2min、95℃5min后，按94℃30s、50℃30s、72℃30s扩增二个循环，再按90℃20s、50℃20s、72℃20s扩增32个循环，最后72℃延伸10min，阴阳性对照按血清样品处理方式同步处理。
1.4 杂交检测
1.4.1 预杂交
取出“通用捕集条”，在每孔中加入100μl杂交液，25μl接头液，A83接头液和内参照(IC)接头液各占一孔，37℃保温1h。
1.4.2 PCR产物处理
取40μl变性液加到PCR产物中，混匀。
1.4.3 杂交
预杂交后，弃去反应液，轻轻倒置于干净吸水纸上5min，然后每孔加入100μl杂交液，在有A83接头液和IC接头液的孔中分别加入25μl变性后的PCR产物，37℃保温1h。
1.4.4 洗板
用自动洗板机洗涤，共5次，每次300μl，将板倒置于干净吸水纸上，去除残留液。
1.4.5 酶联反应
在上述反应板中，每孔直接加入100μl酶联反应液，37℃保温15min。取出后，同上一步骤方法，做第二次洗板。
1.4.6 显色
每孔加入100μl显色混和液，暗处发色10min，再在每孔中加入100μl停显液，读取450nm吸光度值(A450 )。
1.5 实验结果判断吸光度值A450 阴性对照小于0.1、阳性对照大于0.1为实验结果有效，标本A450 吸光度为阴性对照的1.4为阴性，标本A450 吸光度为阴性对照的2.5倍为阳性结果。突变株DNA定量计算方法为:[(样品吸光度值.阴性对照吸光度值).(样品IC吸光度值.阴性对照IC吸光度值)]×200×800。
1.6 统计学方法采用t检验。
2 结 果
2.1 灵敏度检测
将测得HBV DNA前C区A83变异株水平1.9×10 6 copies·ml-1 的血清按1∶10、1∶10
2 、1∶103 、1∶104 、1∶10 5 稀释，结果见表1。对稀释倍数和定量检测结果作双对数曲线分析，r=-0.994，最低检测限为1.3×10 3 copies·ml -1 。
表1 HBV DNA A83变异株不同倍数稀释后检测结果(略)
2.2 HBV A83变异株定量
包括慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌在内的58例慢性肝病及13例乙肝病毒携带者和10例献血员接受了检测，结果见表2。献血员血浆中未检测到HBV DNA。慢性肝病组检测结果对数值为5.37±0.60，乙肝病毒携带者血清中HBV DNA A83变异株水平和慢性肝病组相比较，t=7.54，P<0.001，差异有高度显著性。
表2 不同类型HBV感染者A83变异株定量结果(略)
3 讨 论
对HBV感染者血清中HBV DNA研究较多的前C区变异是第83位碱基(nt1896)由G变为A，即A83变异，由于此变异使得病毒DNA前C区第28位密码子由TGG(色氨酸)转变为终止密码TAG，故又称之为终28变异，变异的结果是前C蛋白翻译中断，HBeAg合成终止。该变异最早由Carman等[3] 于1989年在地中海地区从一个E抗体阳性的活动性肝炎患者中发现，关于A83变异的原因解释有很多种，较新的研究观点综合了以前的研究成果，认为A83变异是以下3个因素的选择结果，即宿主的免疫反应、持续的慢性感染以及干扰素或其它的抗病毒药物治疗[4] 。在美国，有10%的重型乙型肝炎患者存在A83变异，在慢性活动性肝炎中的检出率为12.27%，而在亚州、非州、南欧以及中东的慢性活动性肝炎患者中A83突变率为47.60%[5] ，显示A83突变存在地区性的差异。在江苏常州，慢性乙型肝炎A83检出率为39.2%，肝硬化与肝癌患者A83检出率更高，并且HBeAg阴性的标本A83突变检出率显著高于HBeAg阳性标本[1] ，显示A83突变与HBV感染后病情的慢性化相关。另有文献表明A83变异株对干扰素治疗不敏感，也是干扰素治疗后肝炎复发的一个主要原因[6，7] 。目前检测基因突变的经典方法是基因测序法[8] ，应用聚合酶链反应技术扩增包括前C区在内的HBV DNA片段，以四色荧光对PCR产物进行末端标记，然后在基因测序仪上进行测序分析，基因测序法检测A83突变具有准确性高的特点，但相对较繁琐，而且不能对变异株进行定量检测。ARMS检测乙型肝炎病毒前C区A83突变，简单、快速，检测结果与基因测序法相比差异无显著性，并且通过引入的内参照系统可以对变异株进行定量检测，我们的实验结果显示，ARMS对A83变异株定量检测具有较高的灵敏度，最低检测限达到1.9×103 copies· ml-1 ，献血员血清中未检测到A83变异株，显示此方法在本试验中未出现非特异性扩增，定量检测显示HBV携带者血清中A83变异株水平明显低于慢性肝病组(t=7.54，P<0.001)，提示高水平的HBV A83变异株可能与HBV感染后的病情加重相关，对HBV DNA阳性的“小三阳”患者，进行A83变异株定量检测，并选择适当的抗病毒治疗方案对改善患者的预后、提高患者的生存质量具有一定的临床意义。
[参考文献]
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[8]王永忠，周国平，童福易，等.乙型肝炎病毒前C区变异检测及意义[J].陕西医学检验，2001，16:52.53.
(常州市第三人民医院，江苏常州 213001)
[基金项目] 常州市科技计划资助项目[CS2002(69)-7]。
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