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西地那非对肺动脉高压大鼠肺动脉压力影响的实验研究

http://www.100md.com 2006年6月1日刘浩关勤刘志勇

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    参见附件(279KB，4页)。

     [摘要]

    目的研究西地那非对肺动脉高压发生、发展的延缓及逆转作用，探讨其与内皮素系统的关系。方法单侧肺切除1周后叠加野百合碱60mg·kg-1皮下注射建立肺动脉高压大鼠模型，在野百合碱注射后治疗组大鼠给予西地那非17mg·kg-1·d-1，3周后测量大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室重量与(左心室+室间隔)重量比值[RV/(LV+S)]、肺小血管管壁厚度与血管外径比值，免疫组织化学检测大鼠肺小血管壁平滑肌细胞内皮素1A型受体(ETAR)的表达，放射免疫法检测血浆内皮素1浓度。结果治疗组大鼠mPAP、[RV/(LV+S)]、肺小血管管壁厚度与血管外径比值均低于对照组(P<005)，肺小血管壁平滑肌细胞ETAR的表达较对照组降低(P<005)，血浆内皮素1浓度较对照组升高，但无统计学意义。结论西地那非对单侧肺切除叠加野百合碱注射引起的肺动脉高压、右心室肥厚及肺血管结构重建具有良好的延缓和逆转作用。

     [关键词] 西地那非；肺动脉高压；内皮素；内皮素受体

    [中图分类号] R33；R543.2

    Prevent and reverse effects of sildenafil on pulmonary hypertension

    in pneumonectomy combining to monocrotaline treated rats

    LIU Hao，GUAN Qin，LIU Zhiyong

    (Department of Cardiothoracic Surgery,Zhongda Hospital,Southeast University，Nanjing 210009，China)

    Abstract：Objective To investigate the protective and reverse effects of sildenafil on pulmonary hypertension in pneumonectomy combining to monocrotaline treated rats. Method The SD rats were randomly divided into the shamedoperation group，the control group and the treament group.All the rats were treated with monocrotaline(60mg·kg-1) one week after pneumonectomy. The treament group was treated with sidenafil(17 mg·kg-1·d-1) for 3 weeks. The mean pulmonary arterial pressure(mPAP) and right ventricle/left ventricle and septum [RV/(LV+S)] were measured and the small pulmonary arterial morphologic changes were observed with morphmetric analysis under microscopes. Immunohistochemistry was used to determine the expression of endothelin1 A type receptor(ETAR) on small pumlonary arterial and radioimmunity was used to determine the ET1 level in plasma. Results The mPAP,[RV/(LV+S)],small pumlonary arterial morphologic changes were highly improved in sildenafil group(P<005). The expression of ETAR on small pumlonary arterial was significently reduced in treament group(P<005). The ET1 level in plasma was increased in treament group，but not reach the significant. Conclusion Sildenafil can prevent and reverse the development of pulmonary hypertension in pneumonectomy combining to monocrotaline treated rats.

    Key words：sildenafil；pulmonary hypertension；endothelin；endothelial receptors

    肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是一种以血管重构为主要病理改变的血管增生性疾病，其病因尚未完全阐明，治疗上缺乏有效的手段[1]。以往在对肺动脉高压药物治疗的研究中，人们往往只重视扩张血管，忽略了逆转肺血管重构，所以到目前为止，绝大多数降压药物难以取得满意的长期疗效[2]。临床试验表明，西地那非对肺动脉高压具有降压作用[34]，但该药对肺血管重构及内皮系统的影响目前尚无深入的研究。本实验采用肺动脉高压大鼠模型，研究西地那非对肺动脉高压肺血管重构及内皮系统的影响。

     1 材料与方法

    1.1 实验动物及分组

    雄性SD大鼠30只，体重(2070±13.2)g，由东南大学医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组(10只)、对照组(10只)和治疗组(10只)。

    1.2 药品及试剂

    西地那非由辉瑞公司提供,野百合碱为美国Sigma公司产品,兔抗鼠内皮素1A型受体抗体为以色列Alomone Labs公司产品,内皮素1放射免疫试剂盒为北京华英生物制品有限公司产品。

    1.3 实验方法

    1.3.1 肺动脉高压大鼠模型的建立

    大鼠用戊巴比妥10mg·kg-1腹腔麻醉，在大鼠第3、4气管软骨环间行气管切开插管，连接小动物呼吸机，潮气量为3ml·(100g)-1，频率为60次·min-1。右侧胸骨旁斜行切口，第3、4肋间进胸，对照组和治疗组大鼠于右肺门处妥善结扎后切除右全肺，假手术组大鼠仅做开胸手术，仔细观察无出血后关胸。待大鼠出现吞咽动作后，拔出气管插管。术毕肌肉注射青霉素4万U预防感染。术后1周对照组和治疗组大鼠后颈部皮下注射无水酒精与生理盐水(1∶5)溶解的野百合碱，60mg·kg-1。

    1.3.2 术后处理

    治疗组在注射野百合碱当日开始以西地那非1.7mg·kg-1·d-1灌胃，假手术组和对照组在相同时间以等量生理盐水灌胃。

    1.3.3 肺血流动力学检测及血浆内皮素测定

    3周后大鼠麻醉、气管插管，左侧第3、4肋间进胸，于肺动脉处直接插入微导管，采用NIHON多功能生理记录仪测定肺动脉压，用舒张压+1/3脉压表示肺动脉平均压(mPAP)。拔除测压导管，离断肺动脉，取血2ml于Eppendorf 管中，加入抑肽酶10μl(10万U·L-1)及10%EDTA.Na2 30μl，混匀，4℃ 3000r·min-1离心10min，分离血浆，置于-70℃保存，放射免疫法检测血浆内皮素1的浓度。

    1.3.4 大鼠心室重量的测定及肺血管病理检测

    将大鼠处死取出心脏，测量右心室(RV)及左心室+室间隔(LV+S)重量，然后计算[RV/(LV+S)]，以确定有无右心室肥厚。剪开大鼠左侧胸腔，取出左侧肺组织，剪除其上附着的纵隔组织后置入10%福尔马林液固定，肺门横断取材、石蜡包埋，制片，HE染色。观察肺小动脉形态学改变，测量肺小动脉外径、管腔内径，计算管壁厚度与血管外径比值(WT%)。

    1.3.5 血浆内皮素1检测和内皮素

    1A型受体免疫组织化学染色血标本严格按照说明书进行内皮素1检测；免疫组织化学采用SABC法，按试剂盒说明书进行操作，在光镜下观察各实验组样本的切片，血管壁细胞呈棕黄色染色的细胞为内皮素1A型受体表达阳性的细胞。计数方法：在光镜下选择细胞均匀的视野，循序在100个细胞中计数阳性细胞的个数，并计算阳性细胞指数。阳性指数=(染色阳性细胞数/100)×100%。

    1.4 统计学处理

    各项数据以x-±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析及q检验。以P≤005作为差异有显著性意义。

     2 结果

    2.1 西地那非对PH大鼠mPAP、右心室及肺血管的影响

    见表1。

    表1 各组大鼠mPAP、[RV/(LV+S)]、WT%测定结果(略)

    注：1mmHg=0133kPa

    表1显示，对照组与假手术组比较，大鼠mPAP升高、右心室肥厚及肺血管壁增厚，说明单侧肺切除1周后叠加野百合碱60mg·kg-1皮下注射建立肺动脉高压大鼠模型成功；而西地那非可以有效地降低PH大鼠的mPAP、阻止和逆转右心室肥厚和肺血管壁增厚。

    2.2 西地那非对PH大鼠血清内皮素1分泌的影响

    见表2。

    表2 各组大鼠内皮素浓度值(略)

    表2显示，对照组和治疗组血清内皮素浓度值均较假手术组高，治疗组稍高于对照组，但差异无统计学意义(P>005)。说明PH大鼠血浆内皮素水平明显升高，西地那非也可以促进PH大鼠血浆内皮素1水平的升高，但效果甚微，与对照组比较，差异无统计学意义。

    2.3 西地那非对PH大鼠肺小血管壁内皮素1A型受体表达的影响

    见表3。

    表3 各组大鼠肺小血管壁内皮素1A型受体的表达005(略)

    表3显示，对照组阳性细胞指数明显高于假手术组，说明PH大鼠肺小血管壁内皮素1A型受体的表达明显上调(P<001)；而西地那非可以有效地下调PH大鼠肺小血管壁内皮素1A型受体的表达(P<0.05)。

     3 讨论

    西地那非是一种环磷酸鸟苷(cGMP)特异的5型磷酸二酯酶(PDE5)选择性抑制剂，目前主要用于治疗勃起功能障碍(ED)。Kataoka 等[5]研究发现，依前列醇抵抗的原发性肺动脉高压患者口服西地那非可以明显改善其临床症状和各项血流动力学指标。

    本实验观察了西地那非对PH大鼠肺动脉高压发生发展的影响。对单侧肺切除的大鼠1周后叠加注射野百合碱，3周后其mPAP明显增高，高于假手术组1倍以上，表明大鼠肺动脉高压大鼠模型成功建立。建模后对照组大鼠右心室重量与(左心室+室间隔)重量比值较假手术组显著升高(P<001)，表明肺动脉高压可引起大鼠右心室肥厚；而给予西地那非治疗后，此比值获得明显改善，与对照组比较差异有统计学意义，与假手术组相比无统计学意义。对照组大鼠肺小血管管壁厚度与外径比值较假手术组显著升高(P<001)，表明肺动脉高压大鼠肺小动脉管壁明显增厚，小血管管壁发生严重重构；在给予西地那非治疗后，该比值明显改善，与对照组比较差异具有显著意义。这表明西地那非可以改善肺动高压大鼠右心室和肺小血管的重构，预防和(或)逆转由肺动脉高压引起的右心系统的改变，对肺动脉高压引起的右心及肺血管病变具有良好的治疗作用。

    内皮素1 是一种强烈的可致血管长期收缩的物质[1]，各种原因引起的肺动脉高压患者血浆中内皮素1水平均有较大升高。内皮素1与其A型受体结合可以引起血管收缩，同时也有对平滑肌细胞(SMC)的促分裂作用，并刺激细胞因子和生长因子的产生。内皮素1还可刺激细胞外基质蛋白和纤维连接蛋白的产生，并增强结缔组织生长因子β(TGFβ)和血小板衍生生长因子(PDGF)的作用[6]。在本实验中，我们观察到对照组和治疗组大鼠血浆内皮素1水平均较假手术组有所升高，而治疗组大鼠升高更为明显，但与对照组相比无统计学意义。这表明西地那非可以通过某一未知的途径刺激内皮素1的分泌。然而，有趣的是在应用西地那非后大鼠肺动脉压是降低的，因此，我们认为西地那非可能主要是影响内皮素系统的其他组分，而非内皮素1本身。西地那非可能通过某种途径克服内皮素1的血管收缩作用以及促进平滑肌细胞增殖的作用，从而降低肺动脉压力，并且改善肺动脉高压引起的肺小血管重构。在免疫组织化学检测肺小血管平滑肌细胞内皮素1A型受体时发现，西地那非组该受体表达较对照组明显下调(P<005)，Lyons等[7]实验也证实这一点。这似乎表明西地那非对肺动脉高压的治疗作用是通过影响内皮素系统来发挥的，其对内皮素系统的影响主要是下调内皮素1A型受体的表达从而影响内皮素1与其受体的结合，达到降低肺动脉压力缓解和(或)逆转右心室和肺小血管重构。

    本研究表明，西地那非可以明显地延缓和逆转单侧肺切除叠加野百合碱注射引起的大鼠肺动脉高压的发生发展，阻止和(或)逆转大鼠肺血管和右心室的重构，为临床治疗原发性或继发性肺动脉高压患者提供了另一种思路与方法。

     [参考文献]

    [1]YANAGISAWA M，KURIHARA H，KIMURA S，et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells [J]. Nature,1988,332(6163):411415.

    [2]YUYAMA H,FUJIMORI A,SANAGI M，et al.The orally active nonpeptide selective endothelin ETA receptor antagonist YM598 prevents and reverses the development of pulmonary hypertension in monocrotalinetreated rats [J]. Eur J Pharmacol，2004，496(13):129139.

    [3]TRACHTE A L，LOBATO E B，URDANETA F，et al. Oral sildenafil reduces pulmonary hyension after cardiac surgery [J]. Ann Thorac Surg，2005,79(1):194197.

    [4]WILKINS M R，PAUL G A，STRANGE J W，et al. Sildenafil versus endothelin receptor antagonist for pulmonary hypertension (SERAPH) study [J]. Am J Respir Crit Care Med，2005,171(11):12921297.

    [5]KATAOKA M，SATOH T，MANABE T,et al. Oral sildenafil improves primary pulmonary hypertension refractory to epoprostenol [J]. Circ J，2005，69(4):461465.

    [6]LUSCHER T F，BARTON M. Endothelins and endothelin receptor antagonists:therapeutic considerations for a novel class of cardiovascular drugs [J]. Circulation，2000,102(19):24342440

    [7]LYONS J M，DUFFY Y J,WAGNER J C，et al. Sildenafil citrate alleviates pulmonary hypertension after hypoxia and reoxygenation with cardiopulmonary bypass [J]. J Am Coll Surg，2004,199(4):607614.

    (东南大学附属中大医院心胸外科，江苏南京 210009)

http://www.100md.com/html/paper/1671-7562/2006/03/04.htm

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