荧光光谱法测定外周血ＤＮＡ对恶性肿瘤的筛选价值
 |
| 第1页 |
参见附件(278KB，4页)。
[摘要]
目的 评价荧光光谱法测定外周血DNA对恶性肿瘤的筛选价值。方法 提取恶性实体瘤、白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)及正常人外周血DNA各50份，应用镧系离子荧光光谱分析法检测其荧光强度。结果 恶性实体瘤、白血病、MDS及正常人外周血DNA荧光强度分别为：345.645±28.004、322.988±43.530、308.477±33.834、276.152±29442，3组恶性疾病患者外周血DNA荧光强度均明显高于正常人(P<0001)，且3组之间荧光强度有显著性差异(P<005)。结论 外周血DNA荧光检测对于恶性肿瘤具有一定的筛选价值，且可提高早期诊断率。
[关键词] 外周血DNA；恶性实体瘤;白血病；骨髓增生异常综合征；荧光光谱；镧系离子
[中图分类号] R33；R73
Value of peripheral blood DNA fluorscence spectra in the filtration of malignancy
GU Xiaoyi1,JIANG Zao1, HE Hua2 ,WANG Lingli2 , DENG Lichun3
(1.Department of Oncology, Zhongda Hospital, Southeast University,Nanjing 210009,China；2.Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009,China；3. Department of Oncology, Affiliated Jiangyin Hospital, Southeast University, Jiangyin 214400,China)
Abstract: Objective To evaluate the value of peripheral blood DNA in the filtration of malignancy. Methods Extracting the peripheral blood DNA of 50 patients with various types of malignant solid neoplasias, leukemia,myelodysplastic syndrome(MDS) respectively and healthy individuals ,then detecting the fluorescence intensity by lanthanode fluorescence spectra analysis. Results The mean DNA fluorescence intensity in the malignant solid neoplasias, leukemia, MDS were 345.645±28.004, 322.988±43.530 and 308.4±33.834, respectively. It was obviously higher than that in the healthy individuals (276.152±29.442)(P<0.001). Conclusions Peripheral blood DNA Fluorescence spectra analysis is valuable for the filiration of malignancy，and can rise the rate of the earlier diagnosis.
Key words: peripheral blood DNA; malignant solid neoplasias;leukemia;myelodysplastic syndrome;fluorescence spectra;lanthanide
恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病，早期诊断、早期治疗是提高临床治愈率和改善预后的关键。随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的研究深入,以及分子生物学检测技术的快速发展，外周血DNA及其改变的分子遗传学检测正以其不可替代的优势逐渐被人们所重视,外周血DNA的检测及其遗传学指标的研究将成为未来肿瘤研究的焦点，它为临床肿瘤的早期诊断、预后监测及跟踪随访等提供了方便、快捷、敏感、特异的检测手段。早在1977年Leon等[1]首先发现肿瘤患者血液循环中DNA水平显著高于正常人，之后又有学者报道了肿瘤患者外周血中存在肿瘤特异性DNA。近年来国外相继有学者对恶性肿瘤外周血DNA的水平及性质作了相关研究。探索外周血DNA的检测方法，是定量研究循环DNA的关键。镧系离子铽与环丙沙星结合后可形成稳定的络合物，通过能量转移使核酸发光，大大增强了外周血DNA的荧光强度，使其灵敏度增强。作者主要就该方法对恶性肿瘤的筛选价值进行探讨。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2005年1～6月经细胞学及病理学检查证实的恶性实体瘤、白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)及正常人各50例，抽取其外周血备用。男124例，女76例；年龄20～75岁，中位年龄45岁。其中胃癌19例，结肠癌11例，乳腺癌7例，肺癌13例；白血病患者中M3型3例，M5型1例，ALL型24例，CML型15例,M0型6例,M2型1例；MDS均为RAEBT型。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
所有受检者各取外周血2ml，EDTA抗凝，取250μl全血，应用全血基因组DNA小量制备试剂盒(杭州维特洁生化技术有限公司生产)提取DNA，操作方法按照试剂盒说明书进行。DNA抽提后4℃冰箱保存备用。
1.2.2 试剂配制
(1)环丙沙星贮备液。称取适量的盐酸环丙沙星(广州白云山制药厂生产) 先用01 mol·L-1的HCl溶解后加入缓冲溶液，配制成1.0×10-3mol·L-1的贮备液。(2)Tb3+贮备液。称取适量的Tb4O7(上海跃龙有色金属有限公司生产)，加入少量浓盐酸，加热使其溶解，并挥发至近干，再用01 mol·L-1HCl稀释至500 ml，得1.0×10-2 mol·L-1的贮备液，使用时用水稀释。(3)溴化乙锭贮备液。称取适量的溴化乙锭(Sigma公司生产)，配制成1.0×10-3mol·L-1的储备液，避光保存，使用时以水稀释成所需浓度。
用三羧甲基氨基甲烷(Tris)与HCl配成005mol·L-的Tris/HCl(pH=7.0)缓冲溶液。所有试剂均为分析纯；实验所用水为本实验室自制的重蒸水。
1.2.3 DNA荧光光谱测定
仪器为紫外分光光度仪UV752、荧光分光光度仪RF5301PC(日本岛津公司生产)。测定方法由中国药科大学何华教授提供。
先将抽提的DNA室温下解冻，然后将DNA液转移至10ml容量瓶中，用生理盐水稀释至10ml；在10ml玻璃管中依次加入环丙沙星贮备液100μl、Tb3+贮备液100 μl、Tris液400 μl、稀释的DNA液4ml，最后加入蒸馏水至10ml；静置20min后，在温度25℃下，用1cm石英池，激发光波长325nm，记录发射光波长545nm时的荧光强度并绘制曲线。
1.2.4 统计学处理
实验数据以x-±s表示，采用SPSS12.0软件行t检验处理。
2 结果
恶性实体瘤、白血病、MDS、正常人外周血DNA荧光强度比较见图1、表1。
图1 恶性实体瘤、白血病、MDS和正常人外周血DNA的荧光强度比较(略)
归一化恶性实体瘤、白血病、MDS及正常者(分别为从上至下的曲线)外周血DNA的荧光强度，在发射光波长545 nm及两侧具有良好的对称性。
表1 不同组别受检者外周血DNA荧光强度比较(略)
由图1、表1可见，3组恶性疾病外周血DNA荧光强度均明显高于正常人(P<0001)，且三者之间荧光强度有显著性差异(P<005)。
3 讨论
随着肿瘤分子生物学的发展，循环DNA的检测逐渐受到重视。早期检测DNA的方法包括二苯胺法、溴化乙锭法、对流免疫法及RNADNA杂交法等，但这些方法费时且敏感性低。国外采用放射免疫法、竞争性PCR法、定量PCR法、DipstickTM试剂盒等进行循环DNA定量研究，提高了检测的敏感性及特异性，但价格昂贵。因此，寻找一种既具敏感性及特异性，又经济的方法是当务之急。
Yonuschot等[2]在上世纪70年代就已证明，小牛胸腺DNA和从鼠肝中分离的染色质有增强镧系离子铽荧光的作用。随着分子生物学和生物化学的发展，镧系元素离子已经被用来标记核酸探针来检测DNA或RNA[3]。但尚未见应用镧系离子荧光光谱分析外周血DNA荧光强度的研究报道。本研究建立了一种基于镧系离子荧光的DNA检测方法，将镧系离子铽与喹诺酮类配合物结合后，依照能量共振转移原理，使荧光强度增强，而且镧系离子螯合物的荧光衰变时间长，激发光与发射光之间的Stokes位移大，可最大限度地消除本底荧光干扰，提高检测的灵敏度。我们应用该方法检测了200例外周血标本的DNA荧光强度，发现该方法具有经济、简易、敏感、重复性好、无放射性污染等优点，值得进一步推广研究。
恶性肿瘤患者外周血中存在较高水平的DNA，与正常人之间有显著性差异。正常人血中DNA主要来源于细胞核DNA和线粒体DNA。恶性肿瘤患者外周血中大量DNA来源一般认为主要有以下4种机制:(1)增殖旺盛的肿瘤细胞持续释放DNA进入血液循环[4]；(2)肿瘤细胞的坏死；(3)循环肿瘤细胞或微转移灶的裂解；(4)肿瘤细胞的凋亡。在体外培养的细胞系中,可观察到肿瘤细胞比正常细胞释放更多的DNA[5]。由此可见,外周血DNA在量上与肿瘤相关，且在质上具有肿瘤DNA的特点，这些特点与肿瘤的发生、发展、转移有很大关系。因此，外周血DNA的检测对肿瘤的早期诊断、鉴别、分期、预后等方面有着重要意义[6]。早在20世纪80年代，Chernitskii等[7]和Leiner等[8]分别分析了肿瘤患者与正常人之间血清荧光光谱的差异，试图找到一种肿瘤的实验室诊断方法，但没有取得满意的结果。与其他肿瘤血清标志物相比，外周血DNA具有成分简单、能较好的反映肿瘤代谢等优点。我们应用镧系离子荧光光谱分析法，同时配合高效的DNA抽提试剂盒，检测了恶性实体瘤、白血病、MDS及正常人外周血DNA的荧光强度，结果显示，3组恶性疾病患者外周血DNA荧光强度均明显高于正常人，体现了应用镧系离子荧光分析法检测外周血DNA荧光强度在恶性肿瘤筛选中的应用价值。但是，由于外周血DNA量的改变对于肿瘤的定位存在着较大困难，而且，在炎症、创伤和自身免疫性疾病中也都可出现外周血DNA量的改变，因此，外周血DNA荧光检测对于恶性肿瘤的诊断还需进行进一步临床研究加以验证。
骨髓增生异常综合征(MDS)是恶性克隆性造血干细胞疾病，属癌前期病变。在其向白血病转化过程中会表现为恶性克隆与与正常的造血细胞克隆并存的现象，然后恶性克隆逐渐占主导地位，最终发展成为白血病。在此过程中恶性克隆性造血干细胞会向循环中释放大量的DNA，使外周血中DNA水平明显增高。我们的研究结果发现，MDS患者外周血DNA水平在早期即显著增高，与Sozzi等[9]的报道一致。表明外周血DNA水平的升高可以发生在肿瘤的早期阶段，提示循环DNA水平可能是恶性肿瘤早期诊断的一个重要生物学指标。
肿瘤分子生物学的研究进展,为分析和最终阐明肿瘤的发生开辟了新的天地,血循环游离DNA的检测及其生物学指标的研究,将有可能为临床肿瘤的早期诊断、预后监测及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创和分子生物学检测手段[10]。
[参考文献]
[1]LEON S A，SHAPORO B，SKLAROFF D M，et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy[J]. Cancer Res，1977，37(3):646650
[2]YONUSCHOT G，MUSHRUSH G W.Terbium as a fluorescent probe for DNA and chromatin[J]. Biochemistry，1975，14(8):16771681.
[3]杭建峰，吴英松，李明.时间分辨荧光免疫分析的研究进展及应用[J].热带医学杂志，2004，4(3)：340343.
[4]SIDRANSKY D. Nucleic acidbased methods for the detection of cancer[J]. Science，1997，278(5340):10541059.
[5]FOURNIE G J，LAMBER P H，MIESCHER P A.Release of DNA incirculating blood and induction of antiDNA antibodies after injection of bacterial lipopolysaccharides[J].J Exp Med，1974，140(5):11891206.
[6]GOEBEL G，ZITT M，MULLER H M. Circulating nucleic acids in plasma or serum (CNAPS) as prognostic and predictive markers in patients with solid neoplasias[J]. Dis Markers，2005，21(3):10520
[7]CHERNITSKII E A，GRIGOROVICH N A，SLOBOZHANINA E I，et al. On the changes in the UV fluorescence of blood serum in tumor cases[J]. Dokl Akad Nauk Bssr，1982，26:372375.
[8]LEINER M J，SCHAUR R J,DESOYE G，et al. Fluorescence topography in biology.Ⅲ：Characteristic deviations of tryptophan fluorescence in sera of patients with gynecological tumors[J]. Clin Chem，1986，32(10):19741978.
[9]SOZZI G，CONTE D，LEON M，et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer[J]. J Clin Oncol，2003,21(21):39023908.
[10]ZIEGLER A，ZANGEMEISTERWITTKE U，STAHEL R A，et al. Circulating DNA:a new diagnostic goldmine? [J]. Cancer Treat Rev，2002，28(5):255271.
东南大学附属中大医院肿瘤科，江苏南京 210009
中国药科大学 药物分析系，江苏南京 210009
东南大学附属江阴医院 肿瘤科，江苏江阴 214400
[基金项目] 江苏省自然科学基金资助项目(KB2003080)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(278KB，4页)。