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编号:11039291
银杏叶提取物抗心肌缺血再灌注损伤作用的研究
http://www.100md.com 2006年6月1日 黄维义 张 英 陈 蓉
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    参见附件(275KB，4页)。

     [摘要]

    目的 探讨银杏叶提取物(EGb761)对减轻心肌缺血再灌注(IR)损伤的作用。方法 54只兔随机分入单纯IR组(n=18)、EGb761组(n=18)、EGb761+锌原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)组(n=18)，各组兔分别先给予生理盐水5ml、EGb761(10mg·kg-1)、EGb761(10mg·kg-1)+ZnPPⅨ(7.5mg·kg-1)腹腔内注射。24h后，每组任选6只处死，检测IR前心肌细胞内血红素氧合酶1(HO1)的表达与活性；余兔行心肌缺血40min再灌注4h，检测IR后心肌总抗氧化能力 (TAOC)、丙二醛(MDA)含量、中性粒细胞浸润、心肌梗死范围和心肌细胞凋亡指数(AI)。结果 与单纯IR组比较，EGb761组心肌细胞HO1表达及活性显著升高，TAOC升高，而MDA含量、中性粒细胞浸润及心肌梗死范围和AI均明显降低(P<001)；EGb761+ZnPPⅨ组HO1表达增加但活性反而降低(P<001)，TAOC降低(P<005)，但MDA含量及中性粒细胞浸润明显增加(P<001)，心肌梗死范围及AI则与单纯IR组无显著差异。EGb761+ZnPPⅨ组与EGb761组比较，心肌细胞HO1表达与活性及TAOC明显降低，MDA含量、中性粒细胞浸润及心肌梗死范围和AI则显著升高(P<001)。结论EGb761可通过诱导HO1表达，发挥抗氧化与抗炎作用，有效抑制心肌IR损伤。

     [关键词]银杏叶提取物；血红素氧合酶1；再灌注损伤；凋亡

    [中图分类号] R33

    业已证明，大量自由基特别是活性氧产生介导的氧化应激是导致心肌缺血再灌注(IR)损伤的主要致病机制，而及早有效地进行抗氧化治疗能明显减轻心肌损伤并改善心功能状态[1]。近年研究揭示，血红素氧合酶1(HO1)是一种重要的应激蛋白，与其催化血红素降解生成的产物胆红素及CO一起，组成了机体强大的内源性保护系统，在应对氧化应激、炎症等所致的细胞损伤中发挥有力的保护作用[2]。然而，大多数能诱导HO1表达的理化因素本身(如H2O2、内毒素、重金属、紫外线等)都具有致氧化应激的细胞毒性，故临床应用受到限制。近年发现，银杏叶提取物(EGb761)能诱导体外培养的心肌细胞表达HO1并由此增强细胞抗损伤能力[3]。我们拟进一步探讨EGb761能否预诱导兔在体心肌细胞高表达HO1，并籍此减轻心肌IR损伤。

     1 材料与方法

    1.1 实验分组与动物模型制作

    选用健康日本大耳白兔54只，体重19~23kg，雌雄不拘，随机分为以下3组：单纯IR组(n=18)、EGb761组(n=18)、EGb761+锌原卟啉Ⅸ (ZnPPⅨ)组(n=18)。各组兔分别预先给5ml生理盐水、10mg·kg-1EGb761(贵州益佰制药股份有限公司提供)、10mg·kg-1EGb761+7.5mg·kg-1ZnPPⅨ腹腔内注射。24h后，各组先任取6只活杀，取左室前间壁心肌测HO1表达及其活性。余兔经耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠麻醉，沿胸骨左缘切开，小心剪开心包，保持胸膜完整、兔能自主呼吸。在距冠脉左前降支根部2~3mm处穿线，扎紧线使心肌缺血(心肌呈暗红色)40mim，松开线再灌注(心肌转为红色)，4h后，每组再任取6只测心肌梗死范围，取另6只的缺血心肌作其他指标检测。

    1.2 心肌梗死范围测定

    再灌注结束后再次结扎左前降支，并于左心室内注入2%Evans蓝3ml，2min后摘取心脏，剪下左心室，PBS液洗净后分离未染色心肌称重，代表缺血心肌量，再将其横切成厚2mm的薄片，置于1%TTC中染色10min，分离未染色心肌并称重，代表梗死心肌量，以梗死心肌量占缺血心肌量的百分比代表梗死范围。

    1.3 HO1的表达及HO1活性测定

    采用免疫组织化学染色(SABC)法检测心肌细胞中HO1的表达(抗体购于武汉博士德公司)，显微镜下胞浆染成褐色者即为HO1阳性表达细胞，用CD8病理彩色图像分析系统(成都电子科技大学生产)在200倍光镜下测定5个视野的平均吸光度值代表HO1表达量。另取左心室前间壁部分缺血区心肌加入蔗糖Tris缓冲液制备匀浆，差速离心法分离微粒体，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并根据HO降解血红素生成胆红素的原理，参考何洁[4]的方法测定HO1活性，以每毫克蛋白每小时催化生成胆红素量表示HO1活性(nmol·mg-1protein·h-1)。

    1.4 心肌中性粒细胞浸润检测

    参照Mullane[5]的方法，采用测定髓过氧化物酶(MPO)活性的方法检测缺血区心肌中性粒细胞浸润量，以25℃下每分钟分解1 μmol过氧化物作为1单位(U)。

    1.5 心肌总抗氧化能力(TAOC)及丙二醛(MDA)含量测定

    取缺血区心肌，分别采用化学比色法及硫代巴比妥法，按试剂盒(购于南京建成生物研究所)说明书测定TAOC及MDA。

    1.6 心肌细胞凋亡检测

    取缺血区心肌常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，蛋白酶K10mg·L-137℃处理30min后，使用TUNEL凋亡检测试剂盒(Roach公司产品)检测心肌细胞凋亡。在光镜200倍下观察，核呈棕色者为凋亡阳性细胞，核呈蓝色者为阴性细胞，每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，以凋亡细胞数占心肌细胞总数的比例作为凋亡指数(AI)。

    1.7 统计学分析

    实验所得数据均为计量资料，以x-±s表示，组间比较采用F检验及q检验。

     2 结果

    2.1 IR前各组心肌细胞HO1表达及活性检测结果

    见表1，图1、2、3。

    表1 IR前各组兔心肌HO1表达及HO1活性比较(略)

    图1 单纯IR组呈极弱阳性表达，心肌细胞胞浆染色很浅 SABC法 ×200(略)

    图2 EGb761组呈强阳性表达，心肌细胞胞浆染成深褐色 SABC法 ×200(略)

    图3 EGb761+ZnPPIX组呈弱阳性表达，心肌细胞胞浆染成浅褐色 SABC法 ×200(略)

    与单纯IR组相比，EGb761组心肌细胞HO1表达及活性显著升高(P<0001)，而EGb761+ ZnPPⅨ组心肌细胞HO1表达虽明显增多(P<0001)，但HO1活性却显著降低(P<0001)，EGb761组心肌细胞HO1表达与活性均较EGb761+ZnPPⅨ组明显增加。

    2.2 IR后各组心肌指标检测结果

    见表2，图4、5、6。

    与单纯IR组比较，EGb761组心肌TAOC明显升高(P<001)，MDA含量、中性粒细胞浸润及心肌梗死范围和AI均显著降低(P<001)，而EGb761+ZnPPⅨ组心肌TAOC明显降低(P<005)，MDA明显升高(P<001)，中性粒细胞浸润及心肌梗死范围和AI则无明显变化(P>005)。与EGb761+ZnPPⅨ组比较，EGb761组TAOC明显降低(P<001)，而MDA含量、中性粒细胞浸润及心肌梗死范围和AI均显著升高(P<001)。

    表2 IR后各组心肌指标的比较(略)

    图4 单纯IR组见较多胞核染成深棕色的凋亡心肌细胞 TUNEL标记法 ×200(略)

    图5 EGb761组见少量胞核染成深棕色的凋亡心肌细胞 TUNEL标记法 ×200(略)

    图6 EGb761+ZnPPIX组见大量胞核染成深棕色的凋亡心肌细胞 TUNEL标记法 ×200(略)

     3 讨论

    银杏是现存最古老的孑遗植物，我国对银杏叶药用价值的认识已有上千年的历史，临床上广泛将其用于防治缺血性心、脑、肾等重要器官疾病并取得了良好效果。经现代工艺制成的EGb761包含多种生物黄酮和萜类内酯，其化学成分复杂，具体的药理作用机制至今仍未完全阐明。研究证明，EGb761具有直接清除自由基与抗氧化作用[6]；银杏黄酮还能通过诱导体外培养的心肌细胞表达HO1以增强细胞抗损伤能力，提高细胞存活率[3]。

    我们利用兔在体心脏作研究，发现提前24h腹腔注射EGb761可使心肌细胞中HO1表达及活性显著升高。在此基础上进行急性心肌IR损伤实验，结果显示，与单纯IR组相比，EGb761组心肌梗死范围和心肌细胞AI均显著下降，而EGb761+ZnPPIX组因为加用了HO1特异性抑制剂ZnPPIX，结果在有效阻断HO1表达与活性的同时，完全消除了EGb761对急性心肌IR损伤的上述保护效果。提示提前24h应用的EGb761并非直接起效，而主要是通过诱导心肌细胞高表达HO1间接发挥抗心肌IR损伤的作用，Yet等[7]在大鼠离体心脏灌注实验中也有类似发现，即人为调高HO1表达可显著减轻IR时心脏氧化应激性损伤、改善心功能。根据已有的文献资料，HO1的保护作用可能主要是通过其酶解产物介导的，即HO1催化细胞内游离血红素降解生成胆红素和CO，胆红素是机体内天然的强抗氧化剂，能清除多种自由基，起到抗氧化作用；而CO则是重要的细胞信号分子，具有扩血管、抑制补体活化及抗炎等作用[2]。本研究结果显示，EGb761通过诱导HO1表达而使心肌TAOC显著增加、MDA含量及中性粒细胞浸润明显降低，进一步证实了HO1主要是通过上述抗炎、抗氧化等作用减轻心肌IR损伤。

    众所周知，缩小心肌梗死面积、阻止心室重构是保护急性心肌梗死患者心功能、改善预后的关键所在。虽然溶栓、急诊经皮冠状动脉介入治疗是重建冠脉血流、缩小心肌梗死面积最有效的方法，但再灌注可能促进缺血心肌细胞凋亡，一定程度上引起心肌梗死面积持续扩大和心室重构[8]。本研究结果显示，EGb761通过诱导心肌细胞高表达HO1，不但能有效缩小IR损伤后的心肌梗死范围，还能显著抑制心肌细胞凋亡，表明其在急性心肌梗死的防治中具有独特的应用价值。

     [参考文献]

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    [4]何洁,张敏,刘俊昌,等.血红素氧化酶1在离体大鼠心肌缺血预处理中的作用[J].中国病理生理杂志,2001,17(10):932934.

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    [8]PALOJOKI E,SARASTE A,ERIKSSON A,et al.Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,280(6):H2726 H2731.

    泸州医学院附属医院 心内科，四川 泸州 646000

    泸州医学院 病理生理教研室，四川 泸州 646000

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