STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用(2)
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1.5 扩增产物的检测
扩增完成后,行非连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影。第一步先定性分析：根据等位基因阶梯(ladder)对照阅读各位点的基因型,找出各组供、受体可区分彼此的有信息位点,并选择出Ⅰ类和Ⅱ类位点进行下一步嵌合率计算[3]。第二步定量分析：电泳后的凝胶用UVP成像分析系统进行灰度扫描,再用Gel-Pro4.0软件进行片段分析,选择以下相应的公式计算供体细胞嵌合率(DC)[4-5]。
Ⅰ. a供、受者均为纯合子(没有相同的条带)：DC=D/(R+D)；
Ⅰ. b供、受者均为杂合子(没有相同的条带)：DC=(D1+D2)/(R1+R2+D1+D2)；
Ⅰ. c受者为杂合子,供者为纯合子(没有相同的条带)：DC=D/(R1+R2+D)；
Ⅰ. d受者为纯合子,供者为杂合子(没有相同的条带)：DC=(D1+D2)/(R+D1+D2)；
Ⅱ. 供、受者均为杂合子(有1条带相同)：DC=D/(R+D);
D为供者特异性条带的整合光密度比值,R为受者特异性条带的整合光密度比值。
1.6 嵌合体的界定
完全嵌合体(CC)：DC>95%;混合嵌合体(MC)：5%90%的患者的GVHD发生率明显比DC<90%的患者高。万理萍等[12]也认为，CC的患者的aGVHD发生率高于MC的患者。尽管我们的研究中患者在行DLI后很多出现GVHD,但这并不能说明我们根据嵌合结果实施DLI的治疗会增加患者GVHD的发生率。王椿等[13]对106例病人检测嵌合率并给予个体化免疫治疗,统计发现106例患者的GVHD的发生率并未增加。
[参考文献]
[1] DUBOVSKY J, DAXBERGER H, FRITSC H, et al. Kinetics of chimerism during the early post-transplant period in pediatricpatients with m alignant and non-m alignant hematologic disorders implications for timely detection of engraftment,graft failure and rejection[J]. Leukemia, 1999,13(12)：2060-2069.
[2]李桢,邹红岩,邓志辉,等.短串联重复序列监测异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程[J].中国临床康复,2005,26：99-101.
[3] THIEDE C, FLOREK M, BORNHA M, et al. Rapid quantification of mixedchimerism using multiplex amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection[J]. Bone Marrow Transpl, 1999,23：1055-1060.
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