呼吸链抑制剂对ＨｅｐＧ2细胞ＤＭＴ1表达量的影响
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[摘 要] 目的： 研究缺氧与二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter 1,DMT1)基因表达的关系,观察线粒体有氧呼吸链抑制剂对HepG2细胞DMT1表达量的影响。方法： 将呼吸链抑制剂叠氮钠(NaN3)和鱼藤酮(rotenone)分别与HepG2细胞共孵育,用Western Blot法检测DMT1的表达。结果： 10 mmol/L和20 mmol/L 的NaN3浓度可明显增加HepG2细胞±IRE DMT1的表达;20 μmol/L的Rotenone可明显增加+IRE DMT1的表达,而对-IRE DMT1无明显影响。结论： DMT1的表达受呼吸链的调控,而+IRE DMT1与IRE DMT1的表达调控可能不完全一样。
[关键词] 叠氮钠; 鱼藤酮; 二价金属离子转运蛋白(DMT1)
Inhibitors of Respiratory Chain Change the Expression
of DMT1 in HepG2 Cells
ZHANG Lei, ZHU Li
(Institute of Nautical Medicine, Nantong University, Nantong Jiangsu 226001, China)
[Abstract] Objective: To investigate the relationship between hypoxia and the expression of divalent metal transporter 1(DMT1), we observed the effect of inhibitors of respiratory chain on DMT1 expression. Methods： HepG2 cells were exposed to sodium azide (NaN3) or rotenone and the expression of DMT1 were detected by Western Blot. Results： When HepG2 cells were exposed to 10 mmol/L and 20 mmol/L NaN3 for 1h, the expression of the two isoforms of DMT1 increased; when HepG2 cells were exposed to 20 μmol/L rotenone, the expression of+IRE DMT1 increased, while the expression of-IRE DMT1 only changed little. Conclusion： The expression of DMT1 may be regulated by the respiratory chain, and the expression of the two isoforms of DMT1 may be regulated differently.
[Key words] Sodium azide(NaN3); Rotenone; Divalent metal transport1(DMT1)
1995年Gruenheid等在筛选小鼠天然抗性的巨噬细胞蛋白(natual resistantmacrophage protein 1,Nramp1)时首次发现了与Nramp1基因同源性高达78%,具有相似的二级结构的天然抗性的巨噬细胞蛋白2 (Nramp2)[1]。之后,Gunshin等人[2]在大鼠十二指肠,Fleming等人[3]在小红细胞贫血症小鼠中,均克隆到了二价阳离子转运蛋白(dibalent cation transporter 1,DCT1)基因,发现它与Nramp2具有相同的基因组成和对离子的转运功能。为了更准确的描述这种蛋白的功能,将Nramp2/DCT1重新命名为DMT1(divalent metal transport 1)[4]。通过选择性剪接DMT1 3’端外显子可产生两种不同的mRNA,一种在mRNA 3’端非翻译区域(untranslated region, UTR)含有铁反应元件(iron responsive element,IRE),即为+IRE型DMT1;另一种则不具有IRE,为-IRE型DMT1[5]。
研究证实,肠腔内的三价铁在维生素C[6]及十二指肠细胞色素b(duodenal cytochrome b)的作用下,还原为二价铁,再由DMT1将二价铁转运入肠上皮细胞内[7]。在肠上皮细胞基膜上二价铁在膜铁转运辅助蛋白(hephaestin)[8]的作用下变成三价铁,再经过基膜上IREg1[8]和Ferroportin 1[9]的介导由肠上皮细胞进入血液循环。三价铁离子在血循环中经内吞作用形成内吞泡而被吸收入红细胞内,在三价铁离子从内吞泡内释放入胞质的过程中DMT1是必需的[10]。
研究表明,线粒体缺陷和过度氧化应激导致的神经元损伤与许多神经退行性疾病(neurodegeneration diseases, NDs)相关,包括阿耳茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)等[11],但病理机制尚未阐明。另有研究证实,AD和PD患者病变脑区铁异常增高。新近的研究显示,脑铁异常增高的原因可能是由于某些脑内铁转运蛋白表达失控所致[12-14]。DMT1表达失控引起的脑内铁代谢紊乱可能也与某些NDs的发生发展有关。叠氮钠(NaN3)和鱼藤酮(rotenone)分别是线粒体有氧呼吸链复合体Ⅳ细胞色素C氧化酶和复合体ⅠNADH泛醌还原酶的抑制剂。本实验分别用NaN3和rotenone与HepG2细胞共孵育,并用Western Blot法检测HepG2细胞DMT1的表达量,初步探讨线粒体有氧呼吸链的抑制对DMT1表达的影响以及NDs发生发展的病理机制。
1 材料和方法
11 细 胞
大鼠肝癌HepG2细胞株由南通大学免疫学教研室惠赠。
12 药品与试剂
RPMI1640培养基:Gibco 公司产品;胎牛血清:杭州四季青产品,用前加热灭活,-20℃保存;胰蛋白酶:Sigma公司产品;多聚赖氨酸:Sigma进口分装,用双蒸水配制,4℃保存;抗DMT1抗体(+IRE DMT1和-IRE DMT1):购自于ADI公司;抗βactin抗体:Sigma公司产品;HRP连接的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG二抗:购自于Pierce公司;免疫印迹化学发光试剂ECL:北京普利莱公司;叠氮钠:化学纯,上海试剂采购供应站;鱼藤酮:Sigma公司产品,用DMSO溶解。
13 HepG2细胞的培养
HepG2细胞用RPIM1640完全培养液(含10%胎牛血清)在以多聚赖氨酸包被处理过的培养瓶中培养,置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱内,每隔3～4 d换液1次。当细胞铺满瓶底约80%时予以传代。传代时先将完全培养液吸净,加入浓度为025%的胰蛋白酶3 ml,用吸管不断吹打,1 min后,加入3 ml含10%胎牛血清的RPIM1640完全培养液以终止胰蛋白酶的消化作用。然后用吸管吹打使其悬浮并成单个细胞,将所得细胞悬液离心1 000 r/min×5 min,弃上清,加入RPIM 1640基础培养液洗涤两次。最后将沉淀重悬于含10%胎牛血清的RPIM1640完全培养液中,以1×106个细胞/ml的密度接种于培养瓶中用于提取蛋白进行Western Blot 分析。
14 实验分组
141 NaN3对HepG2细胞DMT1表达量的影响 HepG2细胞铺满瓶底约80%后,分为正常对照组和不同浓度(10 mmol/L,20 mmol/L,40 mmol/L)的NaN3处理组。将各培养瓶内完全培养液吸净,用RPIM 1640基础培养液冲洗两次,每瓶中加入4 ml基础培养液,在NaN3处理组各瓶中加入一定量的NaN3贮存液,使NaN3的终浓度分别达到10 mmol/L,20 mmol/L和40 mmol/L。正常对照组中则不加入NaN3。1 h后,提取正常对照组和处理组各培养瓶中的全细胞蛋白,用于Western Blot分析。
142 Rotenone对HepG2细胞DMT1表达量的影响 将HepG细胞分为正常对照组和rotenone(1 μmol/L和20 μmol/L)处理组,各瓶细胞均用RPIM 1640基础培养液冲洗两次,每瓶中加入4 ml基础培养液。由于rotenone贮存液用DMSO溶解,浓度为4 mmol/L,故使用时正常对照组中加入20 μl DMSO,1 μmol/L rotenone中加入1 μl rotenone贮存液及19 μl DMSO,20 μmol/L rotenone组中则加入20 μl rotenone贮存液即可。24 h后提取各组全细胞蛋白,用于Western Blot分析。
15 DMT1表达量的检测
151 全细胞蛋白的提取 各组细胞移去培养液,用冰冷的PBS洗两遍,然后置于冰台上,加入一定量的全细胞裂解液,用细胞刮刮取瓶中的贴壁细胞,分别收集于相应的15 ml 微量离心管中,4℃冰箱中静置30 min后,用超声波细胞粉碎机粉碎细胞(30 s),低温离心(4℃,12 500 r/min,10 min),吸上清液(全细胞蛋白提取液),分装于EP管中,-20℃保存。
152 Western Blot 用牛血清白蛋白(BSA)作标准蛋白,对各样品全细胞蛋白提取液进行蛋白定量后,每个样品取蛋白30 μg,100℃水浴中煮沸5 min,利用BIORAD电泳和转膜系统,100 V恒压下电泳约15 h,350 mA恒流下转膜2 h,5%脱脂奶粉封闭抗体2 h后,加入抗DMT1抗体 (+IRE DMT1 1∶1 000,-IRE DMT1 1∶1 000),或加入抗βactin抗体(1∶1 000),4 ℃过夜,PBS洗涤三次后加入相应的二抗(1∶1 000)于室温下作用2 h, PBS洗涤3次,ECL孵育5 min后,用胶片显影。
16 数据处理
采用stata70统计分析软件对实验结果进行统计学分析,各组数据以均数±标准差表示。蛋白质印迹结果均经过重复,用凝胶图像分析仪拍摄照片后,用四星图像处理系统测定各组蛋白间的特异性蛋白表达量与内参表达量的比值,进行单因素方差分析及t检验来比较各组之间的差异显著性。
2 结 果
21 NaN3对HepG2细胞DMT1表达量的影响
HepG2 细胞在分别经过0 、10、20 mmol/L及40 mmol/L NaN3处理1 h后,提取全细胞蛋白进行Western Blot分析。图1显示,在NaN3浓度为10 mmol/L及20 mmol/L时,DMT1两种异构体的表达量与未用NaN3处理过的相比,均有明显的增加,当NaN3浓度为40 mmol/L时,两者的表达量稍有下降。
22 Rotenone对HepG2细胞DMT1表达量的影响
HepG2 细胞在分别经过0、1及20 μmol/L rotenone处理24 h后,提取全细胞蛋白进行Western Blot 分析,图2显示,+IRE DMT1在rotenone浓度为20 μmol/L时,其表达量比0 μmol/L时有明显的增加(P<005)。而无论用哪种浓度的rotenone,HepG2 细胞其IRE DMT1的表达与0 μmol/L时相比无明显改变(P>005)。
3 讨 论
在机体的能量代谢过程中,ATP是最主要的高能磷酸化合物,它联系着能量的释放、储存和利用,是体内所进行的各种生命活动所需能量的直接提供者。细胞内ATP生成的主要方式是氧化磷酸化,即在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化,生成ATP。可见,呼吸链的组成及功能完整与否,对机体的能量代谢有着举足轻重的影响。
我们的实验证实,当NaN3 浓度为10 mmol/L及20 mmol/L时,HepG2细胞±IRE DMT1的表达量与未用NaN3处理过的相比,均有明显的增加,当NaN3浓度为40 mmol/L时,两者的表达量稍有下降。而在用rotenone处理HepG2细胞时,尽管对细胞DMT1表达影响的效应不如用NaN3来得明显,但当rotenone浓度为20 μmol/L时,仍可观察到+IRE DMT1的表达量比未用rotenone时有明显的增加。
当NaN3和rotenone抑制呼吸链后,细胞内ATP的产生受到影响,而此时DMT1表达的增加,可使铁从细胞外转运入细胞内增加,这将有利于需要用铁来作辅助因子与能量代谢有关的一些蛋白,如血红素蛋白、顺乌头酸酶等的合成增加,这可能是机体对呼吸链受到抑制时进行调节的一种方式,DMT1参与了这个调节过程。
Rotenone为呼吸链复合体Ⅰ的抑制剂,当复合体Ⅰ被抑制后,沿琥珀酸氧化呼吸链即从复合体Ⅱ进行的电子传递仍可进行;而NaN3的抑制位点是在复合体Ⅳ细胞色素c氧化酶,使从复合体Ⅰ和复合体Ⅱ传递过来的电子都不能传给O2,所以rotenone对呼吸链的抑制作用远不如NaN3彻底。我们的实验也表明rotenone对大鼠HepG2细胞DMT1表达增加的效应不如NaN3显著。
我们的实验结果也支持这样的推测,即在阿尔茨海默症和帕金森氏病等神经性退行性疾病(NDs)的患者病变脑区所出现的铁异常增高,可能正是由于诱发这些疾病发生的线粒体缺陷和过度氧化应激导致的神经元损伤引起DMT1表达增加,使细胞摄入铁增加所致。
本实验证实了线粒体有氧呼吸链的抑制剂NaN3和rotenone能够增加HepG2细胞DMT1的表达,提示DMT1的表达可能受呼吸链的调控,这为研究NDs发生发展的病理机制提供了一个新的实验依据。
[参考文献]
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(南通大学航海医学研究所, 江苏 南通 226001)
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