江苏省乙型肝炎病毒基因型分布与临床相关性
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参见附件(284KB，4页)。
[摘 要] 目的： 了解江苏省乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布及其临床相关性。 方法： 选择江苏省HBVDNA阳性慢性HBV感染者215例,其中HBsAg携带者3例,急性乙型肝炎3例,慢性乙型肝炎166例(轻度80例、中度50例、重度36例),肝硬化27例,原发型肝癌12例,重症肝炎4例,采用S区基因测序法检测HBV的基因型。结果： 215例HBVDNA阳性血清标本中,B基因型72例(335%),C基因型132例(614%),B+C基因型11例(51%);未发现A、D、E、F、G、H型;C基因型肝癌+肝硬化+重症肝炎+慢性乙肝(中度+重度)显著高于B型与B+C型(P<005),C基因型的病程明显较B基因型和B+C基因型长(F=17615),γ干扰素B基因型感染者的血清含量比C基因型和B+C基因型感染者的血清含量显著高(F=13652),S2+S3+S4方面C基因型比B基因型和B+C基因型显著增多(P<005), 结论： 江苏省存在HBV的B、C和B+C三种基因型;以C基因型为江苏省优势毒株;并且C基因型病程长,肝纤维化程度明显,严重的肝病以及原发性肝癌的患者中所占比例显著高于其他基因型。
[关键词] 乙型肝炎病毒; 基因型; 基因测序; 分布; 临床相关性
Distribution of Hepatitis B Virus Genotypes in Jiangsu Province
and Its Clinical Significance
JING Jisheng， HUANG Pei， RUAN Chengrong， WANG Shuncai, et al
(Department of Infectious Diseases,the Jurong People's Hospital, Jurong Jiangsu 212400, China)
[Abstract] Objective: To Investigate the distribution of hepatitis B virus genotype in Jiangsu and its clinical significance. Methods： Serum samples from 215 HBV DNA positive patients with chronic HBV infection,including 3 asymptomatic HBV carriers(ASC), 3 acute hepatitis(AH), 166 chronic hepatitis(CH),(mild 80,moderate 50 severe36); 27 Liver cirrhosis(LC); 12 hepatocellular carcinoma(HCC) and 4 fulminant hepatic failure(FHF) patients were collected and tested for HBV genotypes by sregion gene sequencing. Results： Of the 215 patients,742(335%)were genotype B、132(614%) were genotype C and B+C 11(51%) were genotype.A、D、E、F、G and H genotype was not discovered.C genotype was more than B genotype and BC combination genotype in hepatocellular carcinoma+liver cirrhosis+fulminant hepatic failure+chronic hepatitis (moderate+severe) significantly(P<005).Course of C genotype was longer than B genotype and BC combination significantly (F=17165). αIFN content of B genotype was more than C genotype,BC combination significantly(F=13652). C genotype was more than B genotype and BC combination in S2+S3+S4significantly(P<005). Conclusion： Genotype B、genotype C and BC combination exist in Jiangsu Province and genotype C is the major genotype in the area especially in course、hepatic fibrosis and the rate of the endstage liver disease and LC.
[Key words] Hepatitis B virus； Genotype； DNA sequencing； Distribution； Clinical interrelation
目前依据S区基因的序列异质性大于或等于4%,将乙型肝炎病毒(HBV)分为AH八种基因分型[1，2],基因型反应了HBV自然感染发生变异特点,是病毒变异进化的结果,越来越多的证据表明,HBV基因型可能与病毒感染途径,基因突变,疾病的进程,抗病毒疗效具有一定相关性[3，5],且不同地区分布不一致。我们对江苏省215例乙型肝炎患者进行HBV基因分型,分析江苏省基因型分布的规律,并结合肝穿活检病理检查分析基因型与临床相关性。
1 材料与方法
1.1 病例选择
本研究自2004年11月至2005年5月收集215例乙型肝炎病毒感染患者血清,并获得所有患者肝脏组织学资料,按中华医学会传染病与寄生虫病学分会2000年西安会议修订诊断标准[6],诊断为:HBsAg携带者3例(占14%),急性乙肝3例,慢性乙型肝炎166例(占772%)(其中轻度80例、中度50例、重度36例),肝硬化27例(占126%),肝癌12例(占56%),重症肝炎4例(占19%),年龄10~69岁;所有患者均来自江苏省省辖市,HBVDNA均阳性,排除丙型肝炎病毒感染和其他导致肝脏病变疾病,留取血清5 ml,-70℃保存。
1.2 实验方法
1.2.1 主要试剂及仪器 Taq:Promega公司,γ干扰素采用Elisa法,试剂盒为Biosourse公司提供。HBVDNA用荧光定量法PCR检测,PCR仪型号PTC200;DNA测序仪ABI377;肝功能检测采用贝克曼公司自动生化仪。
1.2.2 HBVM的检测 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBbAb、HBcAb检测用Elisa法,按试剂盒(Abott)说明书操作。
1.2.3 HBVDNA定量 采用PTC2000扩增仪按试剂盒(Promega公司提供)操作说明。γ干扰素由江苏大学马洁博士研究生完成。
1.2.4 HBVDNA基因分型 血清HBVDNA提取(由南京医科大学分子生物学教研室完成):100 μl血清加入裂解液400 μl(1 mmol/L TrisHCl,pH 80,10 mmol/L NaCl,1% SDS,08 mg/ml蛋白酶K),充分混匀,37℃ 5 h后,加酚、氯仿-异戊醇250 μl,充分混匀,9 700 r/min离心5 min;上清液(约350 μl)加无水乙醇700 μl和3 mol/L NaHc,混匀,-20℃过夜,13 000 r/min,离心5 min,4℃,弃去上清液,自然干燥20 min,双蒸水30 μl溶解,-20℃保存备用。
PCR扩增S区(由南京医科大学分子生物教研室完成):该区为长度541 bp(nt 256796),所用引物sense:nt 256278 5′GTGGTGGACTTCTCAATTTT3′,Antisense:nt 796776 5′CGGTAAAAAGGGACTCACGAT3′;PCR反应体系组成:HBVDNA模板2 μl,10×聚合酶缓冲液5 μl,MgCl2(25 mmol/L)3 μl(终浓度为15 mmol/L),dNTP(10 mmol/L)1 μl(终浓度为02 mmol/L),引物S(25 μmol/L)1 μl(终浓度为05 mmol/L),引物AS(25 μmol/L)1 μl(终浓度为05 mmol/L);TaqDNA聚合酶 1 μ;ddH2O37 μl;总体积为50 μl;94℃ 5 min;94℃ 45 s,56℃ 30 s,72℃ 90 s(35次循环);72℃ 10 min;2%Agarose胶电泳。 S区基因测序:由上海英俊生物技术有限公司先纯化,以后采用ABI377型号DNA测序仪检测。
1.3 病理学检查
肝组织在B超引导下1秒钟快速穿刺标本,组织长度>15 cm,至少包括3个完整汇管区,病理标本用10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,苏木精-伊红MASSON双染色,光学显微镜多视野观察,病理诊断标准,按病理诊断[6]划分炎症分级G1~4和纤维化S0~4,同时依Knodell系统进行组织活动指数HAI评分(由南京市第二人民医院病理科刘伟主任统一复核)。
1.4 统计学处理
用SPSS120统计软计,计量资料用t检验;不同组的构成比用χ2检验,半定量采用H检验,多组计量指标采用方差分析,以后用Q检验(由江苏大学预防医学系卫生统计学教研室李君荣教授复核)。
2 结 果
2.1 江苏省215例各省辖市基因分布
215例各省辖市基因分布见图1。
由图可见,江苏省除发现B型、C型以及B+C型以外无A、D、E、F、G以及H型;以C基因型占主导,B∶C为1∶18;苏州、徐州、连云港C∶B约为2∶1;南通、无锡C∶B约为4∶1;淮阴C∶B高达13∶1;泰州均为C型;南京、扬州、镇江、常州B型与C型数量相当。
2.2 215例HBV感染者的临床资料及基因型分布[]乙肝病毒感染者的临床资料与基因型分布见表1，表2。 表1 209例HBV感染者的临床资料及基因型分布表2 215例不同基因型乙型肝炎病毒感染的临床特征 由表1可见,209例患者中(由于HbsAg携带者与急性乙型肝炎均为3例,病例数少,未加统计处理),在各基因型中,C型肝癌+肝硬化+重症肝炎+慢性乙肝(中度、重度)显著高于B型与B+C型(P<0.05)。 由表2可见,将上述资料采用方差分析,C基因型的病程明显比B基因型和B+C基因型长(F=17.615)。在γ干扰素方面B基因型比C基因型和B+C基因型显著高(F=13.652)。性别、年龄、HBVDNA定量ALT三组资料无差异(P>005);B型72例(占35%),C型132例(占614%),B+C型11例(占51%)。
2.3 215例不同基因型组织活动指数
不同基因型组织活动指数见表3。表3 不同基因型肝炎患者肝组织活动指数
3 讨 论
HBV基因型分布呈一定的地域性,东南亚地区慢性HBV感染者以B、C基因型为主,但占流行主导基因型各地存在一定差异。在我国HBV基因型以B、C型为主,北方地区C型为主,南方以B型为主[7~9]。本研究组发现,江苏省以B、C和B+C混合型为主。未发现A、D、E、F、G、H型。以C型为优势基因型,占614%(132/215);而B型占335%(72/215);B+C混合型仅为5%(11/215);B型和C型比例为1∶18,且13个省辖市内分布(除淮阴、泰州以外)无显著性差异,与上述文献报道不一致的原因是江苏处于以长江为界的南北交界区,则分布情况既不同于北方地区,也不同于南方地区,这与文献报道在优势基因型方面不同。
基因B型和C型两种临床不同诊断类型构成比情况显示,肝硬化、重型肝炎、肝癌以及慢性肝炎(中度、重度),C型所占的比例明显高于B型,慢性肝炎轻度,HBsAg携带者以及急性肝炎无明显差异,考虑C基因型可能是严重肝病直接影响因素,与文献报道一致[10、11],这与HBV C基因启动子(CP)发生变异,多见于C基因型相关,本研究还发现,C1653→T和T1753→C,两点变异多发生于C型,并认为上述两点变异,类似于A1762→T和G1764→A双突变,同时X区核心基因起动(CP),变异主要为1858碱基位点为胞嘧啶(C)的C基因型,故可解释C基因型与慢性乙肝加重发展为HCC肝癌密切相关。
由于当抗原刺激机体产生细胞免疫及体液免疫应答的强弱高低与Th1、Th2细胞因子的分泌密切相关,γ干扰素在诱导Th1、Th2免疫反应中发挥重要调节作用,高水平γ干扰素可以激活Th1为主的细胞免疫清除病毒,我们观察到B基因型HBV感染者血清γ干扰素水平比C基因型显著升高,说明B基因型患者在病毒感染后可能产生比C基因型感染者更高水平γ干扰素,则可能与B基因型特有的免疫表位更易被MHC分子递呈,激活机体T淋巴细胞、树突细胞和巨噬细胞诱导Th1细胞免疫相关。而C基因型可能由于产生不了针对HBV的特异细胞免疫,病毒在体内复制会导致持续的肝损害。因此C基因型乙型肝炎病毒被机体自然清除明显低,所以C基因型导致慢性比例明显高,与文献报道相符,B基因型C基因型诱导细胞免疫活化差异原因有待进一步研究。
患者感染相同的HBV基因型后其临床表现各异,说明除了病毒基因型外,还有在其他的因素影响宿主感染病毒的转归,HBV基因型亚型和HBV不同基因型位点变异与临床转归相关性有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, et al. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes[J]. J Gen Virol, 1988, 69 (10): 2575-2583.
[2] Norder H, Courouce AM, Magnius LO. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes[J]. Virology,1994, 198(2):489-503.
[3] Mayerat C, Mantegani A, Frei PC. Does hepatitis B virus (HBV) genotype influence the clinical outcome of HBV infection[J]? J Viral Hepat,1999, 6(4):299-304.
[4] Kao JH, Wu NH, Chen PJ, et al. Hepatitis B genotypes and the response to interferon therapy[J]. J Hepatol, 2000, 33(6):998-1002.
[5] Orito E, Ichida T, Sakugawa H, et al. Geographic distribution of hepatitis B virus (HBV) genotype in patients with chronic HBV infection in Japan[J]. J Hepatology, 2001, 34(4):590-594.
[6] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学会联合
(1.句容市人民医院传染科， 江苏 句容 212400; 2.江苏大学医学技术学院；3.常州传染病院； 4.无锡传染病院;
5.苏州传染病院; 6.南通传染病院; 7.泰州市人民医院传染科; 8.扬州大学医学院； 9.盐城市人民医院传染科;
10.淮安传染病院; 11.连云港市人民医院传染科; 12.徐州传染病院; 13.宿迁市人民医院传染科； 14.南京第二医院)
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