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编号:11111581
胰岛干细胞的研究现状与展望
http://www.100md.com 2005年10月1日 施秉银
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    参见附件(353KB，4页)。

     摘要：详细介绍了胚胎干细胞和成体干细胞向胰岛干细胞转化的诱导分化方法及可能途径，用于胰岛干细胞鉴定的基因分子标志及胰岛干细胞促分化因子。并简要介绍了胰岛干细胞治疗糖尿病的研究现状及存在的问题。

    关键词：胰岛干细胞；胰岛移植；糖尿病

    Recent progress and prospects of islet stem cells researches

    Shi Bingyin

    (Department of Endocrinology, First Hospital of Medical College of

    Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

    ABSTRACT: Methods and possible ways of differentiation of embryonic and adult stem cells to isletlike cells, genetic and molecular mark and driving differentiation factors of islet stem cells are introduced. Development of the use of islet stem cells in treating diabetes mellitus and the current problems are discussed.

    KEY WORDS: islet stem cell; islet transplantation; diabetes mellitus

    糖尿病是一种严重危害人类生命健康的疾病。Ⅰ型糖尿病主要因胰岛β细胞破坏引起胰岛素绝对缺乏所致。2型糖尿病患者早期具有胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷的双重因素，但不少患者在疾病晚期也以胰岛素分泌严重不足为主，需要外源性胰岛素治疗。目前对糖尿病的治疗方法均不能满足重建胰岛β细胞分泌功能的需求。多年来人类尝试采用胰腺移植和胰岛细胞移植的方法重建胰腺内分泌功能，但因移植排异、免疫抑制剂的副作用及手术并发症等诸多因素制约了其临床应用及效果。近10余年来由于制备和纯化技术的改进使得从胰腺获得数量多、纯度高而又保持良好活力的胰岛细胞成为可能\[1\]。Shapima等于2000年报道了采用分离自捐献胰腺的胰岛细胞经肝门静脉注入对7例1型糖尿病患者进行移植治疗的结果，并采用非糖皮质激素免疫抑制剂抗排异\[2\]。他们的研究取得了突破性结果，所有接受移植治疗的患者在长达1年的随访中均摆脱了胰岛素的治疗，血糖及糖化血红蛋白恢复正常，且未发生严重的低血糖反应。在以后的随访中有4例保持良好血糖控制达2年以上\[3\]。这一方法被称为“埃德蒙顿方案”(Edmonton protocol)。虽然从这一方案的成功实施中人们看到了胰岛移植治疗糖尿病的新希望，但这一方案中每一位患者需2～3个供体的胰腺才能获得能够保持血糖正常的胰岛细胞。因此，胰腺供体的严重缺乏使其推广应用受到了很大限制。由于干细胞具有自我复制能力和多种分化潜能，理论上可为胰岛移植提供丰富的胰岛细胞来源。因此，近年来人们对胰岛干细胞进行了大量研究，并取得了重要进展。

     1 胰岛干细胞的概念

    干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)和成体干细胞(adult stem cells)。胚胎干细胞是哺乳动物早期胚囊内细胞团(inner cell mass, ICM)中的一种二倍体细胞，可以从植入子宫内膜前的囊胚中获得。ESC属未分化细胞，可分化为各种机体组织细胞。成体干细胞存在于成年动物的组织器官内，成体干细胞的分化和增殖是成年动物机体组织和器官修复和再生的基础。成体干细胞具有多向分化潜能，以前认为分化潜能较窄，但近年来的横向分化(transdifferentiation)研究表明，成体干细胞在一定条件下可转分化为其他组织细胞。胰岛干细胞一般是指未达终末分化状态，能分化增殖为胰岛组织，或起源于胰腺，具有自我更新复制能力的细胞。

    1.1 胚胎干细胞向胰岛干细胞的分化

    现在已经建立了成熟的胚胎干细胞体外培养和分化方法。胚胎干细胞与无有丝分裂活性的成纤维细胞共同培养或加入白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)时可保持未分化状态。由单层转为悬浮状态时，分化过程就开始启动，经过数天就可形成球形拟胚体(embryoid bodies, EBs)，然后在一定条件控制下就可获得分泌胰岛素的细胞\[4\]。Lumelsky等\[5\]从小鼠ESC获得了分泌胰岛素的细胞。其方法是先将ESC在有LIF存在但无滋养层的条件下培养，然后去除LIF即可使其转化为EBs，再在无血清条件下培养，此环境可使其他细胞死亡，存活细胞大多数为巢素蛋白(nestin)阳性细胞。然后再加入碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)促其增殖，即可得到表达胰岛素、胰岛淀粉样多肽及葡萄糖转运子2在内的胰岛样细胞。这些细胞具有葡萄糖依赖性的胰岛素分泌特性。将该类细胞移植到糖尿病鼠的皮下后虽然血糖未明显改善，但移植鼠的体质量保持及生存时间均好于对照组。Soria等\[6\]将构建的胰岛素启动子基因转染小鼠的胚胎干细胞，采用基因捕捉技术筛选出了分泌胰岛素的细胞株，将其移植到链脲菌素(streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病小鼠脾脏后可使其血糖恢复正常。

    虽然上述方法已由ESC成功的定向诱导分化了胰岛素产生细胞，但其效率仍然很低，胰岛素产生细胞仍不足5%。LeónQuinto等\[7\]在最近的报道中采用三歩转分化方法，辅以某些影响胰腺β细胞分化的因子取得了较好效果。其方法为先用Nkx6.1起动子——新霉素抵抗基因质粒转染ESC，然后除去培养基中的LIF、减少血清含量(由15%减至3%)，并加以Sonic hedgehog抗体和烟酰胺培养。Sonic hedgehog在胚胎鼠的胰腺发育过程中是处于抑制状态的，抗Sonic hedgehog处理也可抑制Sonic hedgehog的活性，此可促使Pdx1及胰腺基因的级联表达。进一步经新霉素处理后仅有Nkx6.1阳性细胞得以存活和增殖。经细胞捕捉选择后生长的细胞几乎均为表达Pdx1、Nkx6.1、胰岛素、葡萄糖激酶、葡萄糖转运子2等基因或蛋白的细胞。将其移植到STZ诱导糖尿病鼠的肾被膜下后使其血糖由17.8mmol/L降至8.3mmol/L，并维持至3周实验结束时。相信随着定向分化技术的不断改进和提高，ESC最终可为人类糖尿病的治疗提供良好的胰岛细胞来源。但ESC的利用需考虑伦理方面的因素，而成体胰岛干细胞的应用可摆脱困扰胚胎干细胞的伦理问题，且可进行自体移植。

    1.2 成体干细胞向胰岛干细胞的分化

    近年的研究已经证实，成年哺乳动物体内存在的成体干细胞保持着可分化为不同类型细胞和组织的潜能。从某一组织器官分离出来的组织特异性干细胞可诱导分化为相应的细胞系。这些干细胞还具有横向分化的潜能，比如多能造血干细胞可分化为肝细胞、肌肉细胞、神经细胞等\[8\]。

    胰腺组织是胰岛成体干细胞的主要来源\[9\]。Cornelius等\[10\]于1997年报道从尚未发病糖尿病鼠的胰腺中分离出了能产生胰岛的多能干细胞。该细胞可长期培养并分化为低水平表达胰岛素、胰高糖素及生长抑素的胰岛样结构。Zulewski等人\[11\]的研究发现，人和大鼠胰岛中均存在nestin染色阳性细胞。这些细胞在体外培养能分化为胰腺外分泌细胞、导管细胞、胰腺内分泌细胞及肝细胞等，因此具有干细胞的特征。以后的研究证明，胰腺导管上皮组织更是胰岛干细胞的重要来源。Ramiya等\[12\]最先报道从分离的胰腺导管培养中获得了胰岛干细胞，在体外培养条件下传代了3年。该细胞可培养分化为胰岛样细胞团，将该细胞团移植到NOD鼠(nonobese diabetic mice，非肥胖型的糖尿病鼠)可显著降低其血糖。BonnerWeir等\[13\]从人的胰腺导管细胞培养中也培养出了人胰岛胚芽样细胞团，低浓度的葡萄糖刺激可使其胰岛素含量增多，免疫组化显示该类细胞中有胰岛素及其他胰腺内分泌激素存在。

    除胰腺外，肝脏干细胞等也可在一定条件下转化为胰岛素分泌细胞。我国学者报道鼠胎肝干细胞可在体外转化为胰岛素分泌细胞\[14\]。Yang等\[15\]报道从成年鼠肝脏分离出的能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞的卵圆形干细胞，经培养6个多月后可在100mL/L胎牛血清及高糖环境下诱导转分化为胰岛样细胞团，可表达Pdx1、Nkx6.1、胰岛素、葡萄糖转运子2及胰高糖素等多种具有胰岛细胞特征的基因或蛋白。经葡萄糖刺激后可合成和分泌胰岛素，而肝细胞特异蛋白的表达随之消失。已有研究证实，骨髓、大脑、肌肉及皮肤等均有干细胞存在，并已有将骨髓干细胞转分化为具有肝细胞特性细胞的报道\[16,17\]。Ianus等在骨髓移植研究中发现，骨髓中有转化为胰岛细胞的前体细胞\[18\]。Tang等在最近的研究中已成功将骨髓干细胞转化为胰岛素产生细胞，将该细胞移植到STZ诱导的糖尿病鼠后其高血糖及代谢状况明显得以改善\[19\]。Ruhnke等\[20\]报道，外周血干细胞在体外也可转化为肝细胞和胰岛样细胞。在方法学上从胰腺导管分离的干细胞可能是产生β细胞最有希望的部位，因其转化为β细胞的过程较之来源于胚胎干细胞或骨髓干细胞等要简单的多。

     2 胰岛干细胞的基因和分子标志及促分化因子

    2.1 胰岛干细胞的基因和分子标志

    认识胰岛干细胞基因分子标志对胰岛干细胞的分离、纯化及鉴定等有重要意义。目前认为胰岛干细胞的基因分子标志主要有以下几类：①胰岛素、胰高糖素、生长抑素和胰多肽。这些激素分别由胰岛中的β细胞、α细胞、δ细胞及胰多肽细胞分泌，通常作为胰岛干细胞的标志，可用免疫组化和分子生物学方法检测。②Pdx1。Pdx1即胰十二指肠同源异型盒基因(pancreatic and duodenal homeobox 1)，也称为胰岛素起动因子1(insulin promoter factor 1, IPF1)、生长抑素转录因子1(somatostatin transcription factor 1, STF1)、胰岛十二指肠同源异型盒基因1(islet duodenum hommeobox gene 1, IDX1)。Pdx1是胰腺发育早期表达的一个转录因子，它的表达是胰腺发育所必需的，如果Pdx1表达缺乏就会出现胰腺不发育。现在认为Pdx1即是胰腺发育所必需的，也是影响许多β细胞基因包括胰岛素基因表达的关键因素\[21\]。有研究显示，将Pdx1基因经腺病毒载体转染至某些肝细胞后可使其转化为产生胰岛素的细胞\[22,23\]。③Nestin。nestin最初是在神经干细胞中发现的一种中间丝蛋白，后来证明nestin不仅是胰岛干细胞的分子标志，而且还有促进胰腺内分泌干细胞分化及胰岛素分泌和其他胰腺内分泌细胞分泌的作用。尽管目前人们仍然把nestin作为胰岛干细胞的标志，但有人认为nestin在由胚胎细胞转化而来的许多干细胞均有表达\[24\]。④神经元素3(neurogenin 3, ngn3)。ngn3是在胰腺发育过程中短暂表达的一种蛋白，是胰腺内分泌细胞系的定向因子。ngn3缺失的的小鼠在发育过程中4种胰岛细胞和nestin阳性的胰岛前体细胞都缺无\[25\]。此外还有β半乳糖苷酶(βgalactosidase)、葡萄糖转运子2(Glut2)等。

    2.2 胰岛干细胞的促分化因子

    多能干细胞只能在有一定生长因子或细胞因子存在的条件下才能增殖和分化。Betacellulin和肌动蛋白A(actin A)及肝生长因子均可促进胰腺干细胞团向胰岛素产生细胞的转化。胰高血糖素样多肽1(glucagonlike peptide1, GLP1)在促使nestin阳性细胞及胰腺导管细胞向胰岛素产生细胞的转化中起着非常重要的作用。此外，GLP1还可诱导胰腺干细胞Pdx1的表达\[26\]。bFGF和表皮生长因子可促进由胰腺分离出的干细胞的增殖，而去除bFGF及表皮生长因子，加入actin A、betacellulin、肝生长因子或GLP1可促使转化为胰岛样细胞团。烟酰胺可增加由胰岛干细胞转化而来的胰岛样细胞胰岛素的产生。

     3 胰岛干细胞治疗人类糖尿病的可能途径及展望

    目前胰岛干细胞治疗糖尿病的研究尚处于动物实验阶段，从多利羊的研究中人们得到启示，设想可将糖尿病患者的体细胞核取出，放入一捐献的取核卵细胞中，胚细胞进一步发育后从中取出胚胎干细胞，经诱导分化为胰岛细胞再植入患者体内。这一方法的最大优点为可以避免移植免疫排斥。也可以从糖尿病病人的胰腺、肝脏或骨髓等部位活检分离出干细胞，在体外诱导分化为胰岛干细胞后再移植入患者体内，此也可以避免移植免疫排斥问题\[27\]。另一种可以考虑选择的方法为干细胞输注治疗。干细胞有一重要特性为易于在受损部位定居。1型糖尿病病人常有胰岛的自身免疫损伤，向其连续输入具有转化为β细胞倾向的干细胞，这些干细胞有可能在胰岛部位定居转化为β细胞\[28\]。移植免疫排斥是异体干细胞移植治疗中需要关注和研究的问题，近年来的研究发现异体干细胞治疗可诱导宿主对由干细胞分化而来的器官的免疫耐受而不发生排斥。说明异体干细胞移植所触发的免疫排异要远远低于一般器官移植。

    尽管胰岛干细胞的研究已经取得了重要进展，但也应看到目前利用干细胞技术重建胰岛功能还有很多障碍，用于提取、分离胰岛干细胞及诱导胰岛素分泌细胞成熟的技术仍有待进一步完善。还缺乏一致公认的、可重复的将干细胞转化为β细胞的方法。尚未建立用以鉴定胰岛干细胞的特异方法。Fujikawa等学者最近报道，经胚胎干细胞转化的胰岛素产生细胞在治疗糖尿病鼠时转化成了畸胎瘤而致降糖作用消失\[29\]。因此，干细胞致瘤方面的安全性也有待进一步研究后确定。此外胰岛干细胞移植并不能消除1型糖尿病患者的自身免疫，故只有对1型糖尿病患者的自身免疫得到安全而有效的抑制，才能保证移植的干细胞存活\[30\]。但从近年来的发展速度和趋势我们不难看出，干细胞技术在不久的将来会为我们提供足够的具有胰岛β细胞功能的细胞供临床使用。这必将会给糖尿病的治疗带来巨大变革，使所有需要胰岛素治疗的糖尿病患者都会从中获益。

    参考文献：

    [1\]Lakey JR, Warnock GL, Shapira AM, et al. Intraductal collagenase delivery into the human pancreas using syringe loading or controlled perfusion \[J\]. Cell Transplantant, 1999,8(3):285-292.

    [2\]Shapiro J, Lakey JRT, Ryan LEA, et al. Islet transplantation in seven patients with type Ⅰ diabetes mellitus using a glucocorticoidfree immunosuppressive regimen \[J\]. New Engl J Med, 2000, 343(4):230-238.

    [3\]Ryan EA, Lakey JR, Paty BW, et al. Successful islet transplantation: continued insulin reserve provides longterm glycemic control \[J\]. Diabetes, 2002,51(7): 2148-2157.

    [4\]Roche E, Soria B. Generation of new islets from stem cells \[J\]. Cell Biochem Biophys, 2004, 40(3 suppl):113-124.

    [5\]Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulinsecreting structures similar to pancreatic islets \[J\]. Science, 2001,292(5520):1389-1394.

    [6\]Soria B, Roche E, Bern G, et al. Insulinsecreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocininduced diabetic mice \[J\]. Diabetes, 2000, 49(2):157-162.

    [7\]LeónQuinto T, Jones J, Skoudy A, et al. In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin producing cells \[J\]. Diabetologia, 2004, 47(8):1442-1451.

    [8\]Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells \[J\]. Science, 1999, 284(5417):1168-1170.

    [9\]Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages \[J\]. Nat Biotechnol, 2004, 22(9):1115-1124.

    [10\]Cornelius JG, Tcherne VV, Kao LKJ, et al. In vitrogeneration of islets in longterm cultures of pluripotent stem cells from adult mouse pancreas \[J\]. Horm Metab Res, 1997, 29(6):271-277.

    [11\]Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, et al. Multipotential nestinpositive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes \[J\]. Diabetes, 2001,50(3):521-533.

    [12\]Ramiya VK, Maraist M, Arfors KE, et al. Reversal of insulindependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells \[J\]. Nat Med, 2000,6(3): 278-282.

    [13\]BonnerWeir S, Taneja M, Weir GC, et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue \[J\]. Pnas, 2000,97(14):7999-8004.

    [14\]Feng RQ, Du LY, Guo ZQ. In vitro cultivation and differentiation of fetal liver stem cells from mice \[J\]. Cell Res, 2005,15(5):401-405.

    [15\]Yang L, Li S, Hatch H, et al. In vitro transdifferentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormoneproducing cells \[J\]. Proc Natl Acad Sci, 2002,99(12):8078-8083.

    [16\]Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, et al. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain \[J\]. Exp Hematol, 2002, 30(8):896-904.

    [17\]Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells \[J\]. J Clin Invest, 2002,109(10):1291-1302.

    [18\]Ianus A, Holz GG,Theise ND, et al. In vivo derivation of glucosecompetent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion \[J\]. J Clin Invest, 2003,111(11):843-850.

    [19\]Tang DQ, Cao LZ, Burkhardt BR, et al. In vivo and in vitro characterization of insulinproducing cells obtained from murine bone marrow \[J\]. Diabetes, 2004,53(7):1721-1732.

    [20\]Ruhnke M, Ungefroren H, Nussler A,et al. Differentiation of in vitromodified human peripheral blood monocytes into hepatocytelike and pancreatic isletlike cells \[J\]. Gastroenterology, 2005,128(7):1774-1786.

    [21\]Ferber S, Halkin A, Cohen H, et al. Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocininduced hyperglycemia \[J\]. Nat Med, 2000, 6(5):568-572.

    [22\]Ber I, Shternhall K, Perl S, et al. Functional, persistent,and extended liver to pancreas transdifferentiator \[J\]. J Biol chem, 2003,278(34):31950-31957.

    [23\]Cao L, Tang D, Horb ME, et al. High glucose is necessary for complent maturation of Pdx1VP16expressing hepatic cells into functional insulinproducing cells \[J\]. Diabetes, 2004,53(12):3168-3178.

    [24\]Wiese C, Rolletschek A, Kania G, et al. Nestin expressinga property of multilineage progenitor cells \[J\]? Cell Mol Life Sci, 2004,61(19-20):2510-2522.

    [25\]Jensen J, Heller RS, Tove FN, et al. Independent development of pancreatic αand βcells from neurogenin 3expressing precursors \[J\]. Diabetes, 2000, 49(2):163-176.

    [26\]Abraham EJ, Leech CA, Lin JC, et al. Insulinotropic hormone glucagonlike peptide1 differentiation of human pancreatic isletderived progenitor cells into insulinproducing cells \[J\]. Endocrinology, 2002, 143(8):3152-3161.

    [27\]Serup P, Madsen OD, MandrupPoulsen T. Islet and stem cell transplantation for treating diabetes \[J\]. BMJ, 2001, 322(6):29-32.

    [28\]Leciiner A, Iicabener JF. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the terament of diabets mellitus \[J\]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003, (2):284:E259-E266.

    [29\]Fujikawa T, Oh SH, Pi L, et al. Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cellderived insulinproducing cells \[J\]. Am J Pathol, 2005,166(6):1781-1791.

    [30\]Trucco M. Regeneration of the pancreatic β cell \[J\]. J Clin Invest, 2005,115(1):5-12.

    作者简介：施秉银(1959)，男(汉族)，教授，博士生导师.

    研究方向：糖尿病胰岛素代谢动力学. Tel: (029)85324057; Email: shibingy@chinadoctor.com.cn

    (西安交通大学第一医院内分泌科，陕西西安710061)

    (编辑 韩维栋)

    收稿日期：20050302

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