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编号:11111580
β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定
http://www.100md.com 2005年10月1日 董炜疆 胡海涛 冯改丰 杨广笑 王全颖
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    参见附件(378KB，5页)。

     摘要：目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法 用PCR 扩增BACE特异性小干扰RNA，转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒，再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中，通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果 成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFPU6siBACE。结论 pLXSN/EGFPU6siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。

    关键词：干扰性小RNA；阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白分泌酶

    Construction and identification of eukaryotic expression

    vector of small interfering RNA specific for BACE

    Dong Weijiang, Hu Haitao, Feng Gaifeng, Yang Guangxiao, Wang Quanying

    (1. Department of Anatomy and Histology & Embryology, Medical School of

    Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Xian Huaguang Biological

    Engenier Ld Company, Xian 710065, China)

    ABSTRACT：Objective To construct eukaryotic expression vector of siRNA specific for βsite APP cleaving enzyme(BACE). Methods The BACE targeting siRNA gene was amplified with PCR. The PCR product was inserted into the pUC19/EGFPU6 plasmid. Then the pUC19/EGFPU6siBACE was digested with restriction enzyme, and the retrieved EGFPU6siBACE fragment was subcloned into retrovirus shuttle plasmid pLXSN. Which was then named pLXSN/EGFPU6siBACE. Results The eukaryotic expression vector of small interfering RNA(siRNA) specific for βsite APP cleaving enzyme was successfully constructed. Conclusion Construction of the siRNA targeting βsite APP cleaving enzyme lays the important foundation for using siRNA to prevent the Alzheimers disease.

    KEY WORDS: siRNA; the Alzheimers disease; βsite APP cleaving enzyme

    阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD) 是严重的中枢神经系统疾病之一,患者由于神经细胞的大量死亡而逐渐出现记忆能力、语言能力和知觉能力全面下降,最终会因脑衰竭而死亡。老年斑(senile plaque, SP) 是阿尔茨海默病的主要病理特征之一。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分β淀粉样肽(βamyloid peptide, Aβ)是AD发生的主要原因 \[1\]。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP) 经β淀粉样前体蛋白裂解酶(βsite APP cleaving enzyme, BACE)和γ分泌酶裂解产生的。目前减少Aβ产生的许多方法中，最便捷的就是直接抑制BACE来减少Aβ的生成。因此，抑制BACE成为设计治疗AD 药物的重要靶标，受到人们的广泛关注。

    RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物界一种古老而且高度保守的现象，是基因转录后沉默作用(PTGS) 的重要机制之一。RNAi主要通过核酸酶将双链RNA(dsRNA)切割成21～25nt的干扰性小RNA，即siRNA(small interfering RNA或short interfering RNA)，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现\[2,3\]。

    本研究构建针对Aβ产生的关键限速酶BACE的特异性小干扰RNA真核表达载体。这一工作将为抑制BACE、减少或降低Aβ产量、消除对神经元的毒性作用打下基础，为进一步研究siRNA的作用、探索BACE对Aβ产生的影响、寻求预防和治疗阿尔茨海默病的有效措施奠定了重要的基础。

     1 材料与方法

    1.1 材料

    重组pUC19/EGFPU6 质粒、大肠杆菌E.coli DH5α由华广生物工程公司提供。各种限制性内切酶、T4连接酶、T4 DNA聚合酶、Taq酶、DNA片段纯化试剂盒为Gibco公司产品。编码针对β分泌酶的siRNA的寡聚DNA 由北京三博远志生物技术有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 BACE特异性小干扰RNA的设计

    从GenBank获取人BACE mRNA全序列(GenBank Accession#: NM012104)。根据RNA设计原则，寻找干扰RNA的靶序列：从起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19为任意19个mRNA核苷酸序列)；计算序列中G+C含量占50%左右；该序列用Blast搜寻EST基因库，确认所靶向的基因是唯一的，为BACE特异性，不抑制其他基因的表达，且该部位不存在碱基多态性。最后将序列5′ TGGACTGCAAGGA GTACAA3′确定为RNAi的靶序列。全长发夹结构DNA序列的设计：向上述序列中加入loop区、反向互补序列、转录终止子,以便转录获得shRNA；两端加入SalⅠ、HindⅢ及XhoⅠ酶切位点及保护碱基，便于克隆的片段插入载体；最后得到BACE siRNA的DNA全长序列如下：

    CGTCGACTGGACTGCAAGGAGTACAATTCAAGAGATTGTACTCCTTGCAGTCCATTTT

    TCTCGAGAAGCTTG引物序列为：正向引物：5′C GTCGACT GGACTGCAAGGSalⅠ酶切位点

    AGTACAATTCAAGAGATTGTAC互补序列3′负向引物：5′CAAGCTTHindⅢ酶切位点CTCGAGXhoⅠ酶切位点AAAATGGACTGCAAGGAGTACAATCTC互补序列3′两个引物之间有10bp的互补区。SalⅠ、HindⅢ酶切位点便于实现PCR产物克隆于其他载体，XhoⅠ酶切位点便于产物的克隆以及插入小片段的重组阳性克隆的酶切鉴定。

    1.2.2 PCR扩增BACE siRNA的全长DNA序列

    加入正、负链引物各2μL，dNTP(10mmol/L)2μL，10×PCR缓冲液10μL，TaqDNA聚合酶(10U/μL)1μL，去离子水83μL，反应总体积100μL，进行PCR反应。PCR反应条件：94℃预变性5min ，94℃变性60s，37℃退火60s，72℃延伸60s，共30个循环。72℃延伸5min。PCR 反应物琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收PCR 产物，与pGEMT Easy载体连接，转化E.coli DH5α感受态细菌，蓝白斑筛选，挑选单个菌落作内切酶分析，选出正确的克隆，序列测定采用双脱氧链末端中止法，以ABI 377 DNA 自动序列测定仪进行。测序正确的质粒记为pGEMT/siRNA。

    1.2.3 pUC19/EGFPU6siBACE重组质粒的构建

    用SalⅠ、HindⅢ双酶切pGEMT/siRNA重组质粒及pUC19/EGFPU6质粒，透析袋凝胶电泳洗脱法分别回收目的片段BACEsiRNA和pUC19/EGFPU6载体片段，将BACEsiRNA片段连接入pUC19/EGFPU6载体。XhoⅠ酶切线性化的克隆为重组阳性克隆。获得的质粒记为pUC19/EGFPU6siBACE(图1)。

    pLXSN/EGFPU6siBACE重组质粒的构建用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pUC19/EGFPU6siBACE以及pLXSN逆转录病毒载体，透析袋凝胶电泳法分别回收EGFPU6siBACE片段和pLXSN载体片段，将EGFPU6siBACE片段连接入pLXSN载体。EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切能够切下约1.2 kb片段的克隆为重组阳性克隆。获得逆转录病毒载体穿梭质粒pLXSN/EGFPU6siBACE(图2)。

    β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

     2 结 果

    2.1 pGEMT/siRNA的酶切鉴定

    重组质粒经XhoⅠ酶切可线性化，EcoRⅠ酶切可切下约90个bp的小片段，即说明PCR产物已连于pGEMT Easy载体(图3)。

    2.2 pUC19/EGFPU6siBACE重组质粒的酶切鉴定

    EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，BamHⅠ、SalⅠ双酶切，以及SalⅠ、XhoⅠ双酶切pUC19/EGFPU6siBACE，分别获得大小约730bp、350bp、60bp的片段，与相应的EGFP片段、U6片段以及相应的siBACE片段大小一致，EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pUC19/EGFPU6siBACE获得大小约1.2kb的片段，即EGFPU6siBACE的总长度(图4)。

    2.3 pLXSN/EGFPU6siBACE重组质粒的酶切鉴定

    EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pLXSN/EGFPU6siBACE，获得大小约1.2kb的片段，即EGFPU6siBACE的总长度(图5)。

    获得的pLXSN/EGFPU6siBACE载体中，病毒载体的5′LTR控制EGFP的表达，SV40早期启动子控制新霉素抗性基因的表达，U6启动子转录产生siRNA。

     3 讨 论

    1995 年，Guo 和Kemphues在试图利用反义和正义RNA 影响秀丽新小杆线虫体内的par21 基因表达时，意外发现二者同样地抑制了par21 基因的表达\[4\]。他们当时对这一现象大为不解。直到1998年，Fire 等证实了正义RNA 抑制基因表达，以及过去的反义RNA 对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA 中污染了微量双链RNA而引起。将体外转录得到的单链RNA 纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA 却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA 干扰(RNA interference, RNAi) \[5\]。RNAi 现象广泛地存在于植物、果蝇、拟南芥、斑马鱼、小鼠甚至锥虫等大多数真核生物中，具有广阔而重要的生物学意义。RNA 干扰是双链RNA分子在mRNA 水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程\[6-8\]，其特异性在于所挑选片段的特异性，因为凡是与之配对的相关基因均受其干扰。采用RNA 干扰技术研究基因的功能，所挑选的短链寡核苷酸片段必须是该基因所特有的，基因Blast 为我们提供挑选特异性片段的最佳平台。近年来，RNA 干扰技术广泛用于基因功能研究。

    研究发现，阿尔茨海默病患者的神经细胞周围有大量的Aβ沉积。Aβ沉积对神经元有毒性并在AD的发病中起重要作用。由于Aβ在AD 的发病中起着至关重要的作用，因此减少Aβ的产生，加快其消除，阻止Aβ聚集和形成有毒性的淀粉样斑块，对抗Aβ的毒性和抑制其所引起的免疫炎症反应都可以成为AD 治疗的策略。因此无论是直接或间接的治疗方法，都瞄准Aβ。目前许多学者都看好作用于分泌酶的AD 治疗药物，因为它能从源头上减少Aβ的产生，从根本上阻止AD 的病程发展。要减少Aβ的产量，理论上有三条途径：①α分泌酶的激动剂，可以使APP 避免经过β途径，减少Aβ的产生；②BACE抑制剂；③γ分泌酶抑制剂。其中BACE抑制剂越来越受到人们的关注。为了证实抑制BACE不会对正常组织和细胞产生毒害作用，几个研究小组进行了BACE基因剔除实验\[9\]，研究表明这些基因缺失的小鼠(BACE-/-) 生长正常，对形态学、血液学以及动物行为等分析结果显示它们与正常小鼠(BACE+ /+) 无显著差异，但BACE-/-小鼠的脑和培养的神经细胞中BACE活性消失。用BACE-/-小鼠与Swedish APP过表达的转基因小鼠交配产生的第二代小鼠中也没有过量的Aβ。用表达APP 的腺病毒感染缺失BACE的胚胎神经细胞，通过质谱和凝胶电泳分析显示不产生Aβ。体外分析还发现，在BACE-/-小鼠的脑及培养的神经细胞抽提液中检测不到Aβ及BACE活性。这些实验证实了BACE是体内主要的β分泌酶，抑制BACE的活性在体内不会引起高毒性。BACE缺失小鼠的脑中不产生Aβ，证实了可以通过抑制BACE的活性来降低Aβ的水平，以达到治疗或减缓AD 症状的目的，为BACE作为AD治疗靶点的可行性提供了试验依据\[10\]。

    虽然在哺乳动物细胞中用siRNA进行RNAi的实验技术已经基本成熟，并显示出很好的应用前景，但化学方法合成siRNA费用昂贵、容易降解、作用时间短暂的缺点使它难以普及，在某种程度上限制了RNAi技术在哺乳动物中的应用和发展。新近涌现出了各种siRNA的合成方法，使进行大规模RNAi实验成为可能。其中通过构建载体导入细胞后转录产生siRNA的方法十分简便，费用较为低廉，抑制作用稳定，因而相继有质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体被构建。整体而言，病毒载体的转导效率高于质粒。相对于其他病毒载体，逆转录病毒具有容易包装获得、宿主细胞范围广、病毒载体本身的免疫原性小及高效感染分裂期细胞等特点。本实验通过计算机软件分析BACE的基因序列，按照siRNA设计的原则，设计出BACE靶向的siRNA，并通过基因工程技术构建了能同时表达BACE的特异性siRNA、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及Neor 的逆转录病毒载体。其中Neo 基因的表达可以应用G418筛选稳定转化的细胞克隆；EGFP的表达便于用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察病毒感染效率，或利用流式细胞仪分选表达EGFP的细胞群，并可作为细胞体内示踪的标记。因此具有很大的实用价值，为进一步试验提供了诸多方便。后期的试验可以将该真核表达载体包装成逆转录病毒，并制备高表达APP、BACE等基因、Aβ产量增高的阿尔茨海默病细胞模型。用BACE的特异性siRNA感染模型细胞，构建的BACEsiRNA可对BACE基因在细胞内进行转录后抑制，切割靶基因成为无功能的小片段，达到抑制BACE基因的表达，减少BACE的产生的目的。我们观察感染前后对BACE活性的抑制作用，特别是对阿尔茨海默病的主要致病因素Aβ生成的重要影响，以及减少神经元死亡、降低Aβ毒性作用的效果。本研究室正在制备含APP 瑞典突变型基因(APPSW)的转基因小鼠。这为RNA干扰技术将来应用于哺乳动物奠定了实验基础，对进一步观察RNA干扰技术在治疗阿尔茨海默病中的应用具有重要意义。RNA干扰技术对抑制靶向基因的表达，为寻找最适宜的治疗老年性痴呆的方法提供了新的思路。

     参考文献：

    [1\]Dresse A, Marechal D, ScuveeMoreau J, et al. Towards pharmacological approach of Alzheimer disease based on the molecular biology of the amyloidal precursor protein(APP) \[J\]. Life Science,1994, 55(1):2179-2187.

    [2\]Marjori M, Antonius JM, Matzke J, et al. RNA: guiding gene silencing \[J\]. Science, 2001, 293(5532):1081-1083.

    [3\]Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al. RNAi: double stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals \[J\]. Cell, 2000,101(1):25-33.

    [4\]Guo S, Kemphues KJ.par 21, a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos, encodes a putative SerPThr kinase that is asymmetrically distributed \[J\]. Cell, 1995, 81(4):611-620.

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    [7\]Wrighton CJ, HoferWarbinek R, Moll T, et al. Inhibition of endothelial cell activation by adenovirusmediated expression of IκBα, an inhibitor of the transcription factor NF2κB \[J\]. J Exp Med, 1996, 183(9):1013-1022.

    [8\]Song E, Kyung JS, Wang J, et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis \[J\]. Nat Med, 2003, 9(3):347-351.

    [9\]Roberds SL, Anderson J, Basi G, et al. BACE knockdown mice are healthy despite lacking the primary betasecretase activity in brain: implications for Alzheimers disease therapeutics \[J\]. Hum Mol Genet, 2001,10:1317-1324.

    [10\]Luo Y, Bolon B, Kahn S, et al. Mice deficient in BACE1, the Alzheimers βsecretase, have normal phenotype and abolished βamyloid generation \[J\]. Nat Neurosci, 2001, 4(3):231-232.

    基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30300395)

    通讯作者：冯改丰，Tel: (029)82655178; Email: fenggaifeng@163.com

    作者简介：董炜疆(1975)，男(汉族)，讲师，博士研究生.

    研究方向：老年性痴呆的预防和治疗. Tel: (029)88596754; Email: dongwj@mail.xjtu.edu.cn

    (1. 西安交通大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系，陕西西安 710061；2. 西安华广生物工程公司，陕西西安 710005)

    (编辑 卓选鹏)

    收稿日期：20050224

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