乳兔房室结细胞原代培养及形态特征
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摘要：目的 观察房室结细胞体外分散培养及形态学特征。方法 取新生3d乳兔房室结组织采用差速贴壁分离技术加机械破坏非心肌细胞法进行原代细胞培养，观察记录各类培养细胞的生长状况，并进行细胞化学染色。结果 在培养的房室结细胞中，至少有4种自发性收缩细胞及少量的不规则细胞和多边形细胞。其中梭形细胞最多，圆形细胞和三角形细胞次之，多角形细胞最少；多角形细胞和圆形细胞收缩频率最高，其次为梭形细胞，三角形细胞收缩频率最低。细胞化学染色显示：三角形细胞肌原纤维最丰富，其次为梭形细胞，多角形细胞和圆形细胞肌原纤维最少。结论 兔房室结由多种形态不同的细胞构成，多角形细胞和圆形细胞可能是起搏细胞，梭形细胞可能是过渡细胞，三角形细胞可能是普通心肌细胞。
关键词：房室结；细胞培养；形态学；乳兔
Primary culture of atrioventricular nodal cells in newborn rabbitZhang Ying1，Niu Xiaolin1,2, Ou Yan1, Ling Fengdong3
(1. Department of Cardiology, Second Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710004;2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. Department of Anatomy,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT：Objective To observe primary cultured cells of atrioventricular node(AVN) in detail. Methods The neonatal rabbit AVN cells were cultured and purified with the method of differential attachment and mechanical destructive treatment. The cultured cells were identified by morphology, spontaneously contracting frequency and cytochemical staining. Results Among the cultured cells of AVN, at least four distinctly different types of spontaneously contracting cells were observed ,as well as a few irregular cells and polygonal cells. The greatest proportion of the contracting cells were spindle cells and the second group were round and triangle cells and the last group were polyhornal cells. The frequency of spontaneous contraction was the highest in the polyhornal and round cells, inferior to which was the spindle cells, and the frequency of spontaneous contraction was the lowest in the triangle cells. Cytochemical staining showed that the myofibrillae content in the cytoplasm was triangle cells> spindle cells> polyhornal and round cells. Conclusion The AVN of rabbit was made up by different cells. The polyhornal and round cells may be pacemaker cells; the spindle cells might be transitional cells, and the triangle cells may be myocardial cells.
KEY WORDS: atrioventricular node; cell culture; morphology; newborn rabbit
心肌细胞体外培养技术为人们从细胞及分子水平加深对心血管系统的生理功能和病理机制的认识提供了方便有用的工具，现已广泛应用于心室肌、心房肌及窦房结的形态学、电生理、分子生物学、组织胚胎学以及临床病理学等各方面的研究。然而，迄今未见有关房室结细胞体外分散培养方面的报道。房室结对于心脏正常的活动具有很重要的作用，是心房和心室间唯一的电联结。在一些疾病状态下，房室结有更为重要的作用。为了进一步从单一活细胞的角度研究房室结，我们开展了乳兔房室结细胞的原代培养工作并对培养的活细胞进行较为详细的形态学观察分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
出生3d的普通家兔，每次5只，雌雄不拘，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2 仪器与试剂
Thermo forma恒温二氧化碳培养箱，37XB倒置显微镜，DMEM培养基(GIBCO公司提供)，新生牛血清(杭州四季青公司提供)，胰蛋白酶(SIGMA 公司提供)。
1.2 方法
1.2.1 乳兔房室结细胞的原代培养
取出生3d的普通家兔，75%(体积分数)乙醇浸泡5min后带入净化工作台内。仰卧位剖胸，迅速取出整心，置于冰的DMEM液中，剪去房室环以下心肌，剪开右心房，暴露房间隔右侧面，在解剖显微镜下，于三尖瓣膈侧瓣上方冠状窦口及前方取0.8mm×0.8mm×1mm组织块。将各兔被剪下的组织块收集到盛有DMEM液的小瓶中，轻柔洗涤，吸出DMEM液，加入DHanks液再次轻柔洗涤，将组织块充分剪碎。吸出DHanks液，加入1g/L胰酶5mL，37℃水浴中消化10min，吹打1min，自然沉淀，弃去上清，再加入1g/L胰酶，37℃水浴中消化10min，吹打1min，自然沉淀，吸取上清液，移入离心管，离心管中加入等量DMEM培养液以终止胰酶的消化作用。重复消化5次至组织块基本消化成单细胞为止。经400目金属滤网过滤后将各离心管以1500r/min，离心10min，弃去上清，加入含15%(体积分数)新生牛血清，10万u/L双抗的DMEM培养液，充分吹打，制成单细胞悬液。调整细胞数为(4～10)×105/mL，将单细胞悬液接种于培养皿中，将培养皿置于37℃，5%(体积分数)CO2孵箱中培养120min后，采用差速贴壁分离技术，吸出培养皿中的细胞悬液，收集至另一预先置有消毒玻片的培养皿中，继续培养。每隔2d更换含15%(体积分数)新生牛血清，10万u/L双抗的DMEM培养液一次，换液前采用机械破坏法去除非心肌细胞。
1.2.2 乳兔窦房结细胞、心房肌细胞和心室肌细胞的培养
取乳兔前腔静脉根部0.8mm×0.8mm×1mm组织块、左心房组织、心尖部组织，按前述房室结细胞培养方法，同步进行窦房结细胞、心房肌细胞与心室肌细胞培养，以作对照。
1.2.3 培养细胞的形态学观察
在倒置显微镜下观察各类培养细胞的形态、大小、外观特征，出现单个细胞搏动的时间、出现片层细胞的时间、细胞的生长和增殖情况、搏动频率和节律、合体搏动的情况，并用目镜测微尺测量，拍照，录像。
1.2.4 培养细胞的细胞化学染色鉴定
苏木精伊红(HE)染色：将生长于盖玻片上的培养细胞经乙醇固定后进行常规苏木精伊红染色，光镜下观察并用目镜测微尺测量，拍照。
Masson三色染色：将生长于盖玻片上的培养细胞经Bouin液固定后流水冲洗，Weigerts铁苏木素液染5～10min，水洗，1%(体积分数)盐酸酒精分化，水洗，丽春红酸性品红液染5～10min，蒸馏水洗，10g/L(1%)磷钼酸水溶液处理5min，直接20g/L(2%)苯胺蓝液复染5min，1%(体积分数)冰醋酸处理1min，95%(体积分数)乙醇脱水多次，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，置于光镜下观察并用目镜测微尺测量，拍照。
磷钨酸苏木素染色：将生长于盖玻片上的培养细胞经Zenker液固定后流水冲洗，进行除汞处理\[5g/L(0.5%)碘酒精作用10min，稍水洗，50g/L(5%)硫代硫酸钠液脱碘5min，流水冲洗10min\]，酸化高锰酸钾液作用5min，稍水洗，20g/L(2%)草酸水溶液漂白1～3min，流水冲洗5min，蒸馏水洗1次，磷钨酸苏木素液染24～48h，直接用95%(体积分数)乙醇迅速洗去多余染液，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，置于光镜下观察并用目镜测微尺测量，拍照。
1.2.5 统计学处理
所测结果以±s表示，组间比较作SNKq检验。
2 结果
2.1 培养细胞的倒置显微镜观察
培养至第6天，经倒置显微镜观察，见培养细胞主要有6种形态：①胞体较小的多角形细胞(图1)；②胞体较小的圆形或椭圆形细胞(图2)；③胞体较小的梭形细胞(图3)；④胞体中等的三角形细胞(图4)；⑤胞体最大的不规则细胞；⑥胞体中等的多边形细胞。其中前4种细胞可见搏动，前3种细胞搏动的节律为匀速搏动，第4种细胞搏动的节律为加速搏动约30s后缓慢搏动至停止搏动，静息约20s后再次加速搏动。各类搏动细胞的形态、搏动频率详见表1。而第5种和第6种细胞从未见搏动。且在应用差速贴壁分离技术时，将120min内贴壁的单细胞继续培养观察，发现均为第5种细胞，推测此类细胞即成纤维细胞。房室结培养细胞中以梭形细胞最多，同期对照培养的窦房结细胞以圆形细胞最多，心房肌、心室肌则主要为三角形细胞。培养细胞中各类搏动细胞的分布情况详见表2。表1 各类搏动细胞的形态大小及搏动频率(略)表2 各类搏动细胞的分布(略)
2.2 细胞化学染色光镜观察
苏木精伊红染色(图5)：①多角形细胞：胞体小，呈不规则多角形，突起多，3～6个，胞核圆或椭圆，核大，达胞体一半，核仁明显，胞浆染色较浅。②圆形细胞：胞体小，呈圆形或椭圆形，胞核圆形，核大，达胞体一半以上，核仁2～4个，清晰可见，胞浆染色较浅。③梭形细胞：胞体小，呈梭形或纺锤形，胞核中等，椭圆形，核仁明显，2～3个，胞浆染色中等。④三角形细胞：胞体中等大小，呈三角形或柱状，核椭圆，中等大小，位于中央，核仁明显，胞质染色中等。⑤不规则形细胞：胞体大，呈不规则梭形，突起多，有时大突起带有小突起分支，胞核大，椭圆形，胞浆染色浅。⑥多边形细胞：胞体较大，呈不规则4～6边形，核大，椭圆形，胞浆染色极淡。
Masson三色染色(图6)：此染色主要用于显示兰色的胶原纤维。染色结果显示房室结、窦房结、心房肌、心室肌培养细胞玻片上均几乎未见细胞体附近或细胞与细胞之间有兰色的块状物，未见片层细胞中间有兰色块状物，染片上偶可见兰色纤维状结构。
磷钨酸苏木素染色：此染色主要用于显示细胞内肌原纤维的有无、多寡。①多角形细胞：胞浆染色较深，肌原纤维少，位于核附近，核大而圆，核仁明显(图7)。②圆形细胞：胞浆染色深，肌原纤维少，围绕于核附近，核大而圆，核仁明显(图8)。③梭形细胞：胞浆染色较深，肌原纤维较多，位于核附近或核两端，与细胞长轴平行，核仁明显(图8)。④三角形细胞：胞浆染色较深，肌原纤维丰富，位于核附近或核两端，与细胞长轴平行，核仁明显(图9)。⑤不规则形细胞：胞浆染色浅，未见肌原纤维，核仁明显(图9)。⑥多边形细胞：胞浆染色浅，未见肌原纤维，核大而圆，核仁明显(图5)。多角形细胞、圆形细胞、梭形细胞和三角形细胞的大小详见表1。
3 讨论
乳兔房室结的准确定位与取材，是进行房室结细胞培养的关键步骤之一，因为定位取材是否准确将直接影响培养细胞中各细胞所占的比例。我们参阅了许多兔房室结及房室结分离细胞的形态学方面的文献(1-3)，并首先进行了3套乳兔整心连续切片，作了详细的光镜观察，确定了乳兔房室结及窦房结的结构和位置。经这样的前期准备工作后，再取材做细胞培养，即可提高取材的准确性及培养细胞模型的参考价值。
对于心肌细胞的单细胞的形态学研究，不同的学者观察到了不同的结果\[1,4,5\]。究其原因可能为：①受研究动物物种不同的影响。②受研究方法不同的影响。目前获得单细胞的一般方法多采用酶消化组织来获得急性分离的单细胞。这种方法首先应用于房室结电生理实验，但存在着一些缺陷。因为急性分离的单细胞不能长时间存活，在操作过程中机械作用和酶的消化作用可使细胞遭到破坏，特别是细胞的膜蛋白，细胞的活力大大减低，对于心肌细胞的单细胞的形态学研究也有较大的影响。比如，通过电镜观察到无论在窦房结、房室结还是心房、心室均可见到细胞具有数量巨大的细指状末梢突起\[5-7\]，而急性分离的单细胞的形态学观察中较少见细胞的末梢突起\[1,3\]，在培养细胞的形态学观察中可见细胞均有较多的末梢突起\[8\]。因此，与急性分离心肌细胞相比，心肌培养细胞具有更多的优点。它能提供单个细胞的同源性集落；可以为酶解分离过程中的损伤提供修复时间，包括被破坏的膜蛋白的重新表达；比急性分离心肌细胞更适于较长时间的研究等。因此，可以预计，房室结细胞体外分散培养在今后的房室结研究工作中将有很好的应用前景。对于兔房室结单细胞的形态学特征，国内外现有的许多文献报告\[1,3,9\]均为分离房室结细胞，尚无房室结培养细胞的形态学研究的文献。结合兔窦房结单细胞形态学的研究\[5,8\]，起搏细胞多被观察到为蜘蛛状、圆形或梭形，体积小而搏动频率快，胞浆中肌原纤维不发达，只有少量散乱或成束的肌丝；心房肌与心室肌细胞较易辨认，其体积大而搏动频率慢，呈三角形或杆状，胞浆内有大量的肌原纤维，可以看到肌横纹；过渡细胞的体积与搏动频率、胞浆内肌原纤维的数量均界于前二者之间，形态多为长梭形或细长形。我们观察到在房室结、窦房结、心房肌、心室肌细胞培养中不仅仅是某一种具有收缩性的细胞存在于某一部位，而是在一个部位培养中同时存在几种具有收缩性的细胞。从本文所述的4种具有收缩性的细胞的分布来看，房室结中以梭形细胞为主，其次为圆形细胞、三角形细胞，以及少量的多角形细胞；窦房结以圆形细胞为主，其次为梭形及三角形细胞，也有少量多角形细胞；而心房肌和心室肌均以三角形细胞为主。同时，这4种具有收缩性的细胞中多角形细胞、圆形细胞的搏动频率最快，梭形细胞次之，三角形细胞搏动最慢。而磷钨酸苏木素染色显示三角形细胞的肌原纤维最丰富，梭形细胞次之，多角形细胞和圆形细胞最少。因此，根据每一种细胞在不同部位培养细胞中的多寡，每一种细胞的形态大小、搏动频率、胞浆中肌原纤维的多寡，结合与乳兔原位房室结细胞形态学观察的对比，我们推测多角形细胞和圆形细胞可能是起搏细胞，梭形细胞可能是过渡细胞，三角形细胞可能是普通心肌细胞。
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基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(No. 99SM62)
通讯作者：牛小麟，Email: niuxl@mail.xjtu.edu.cn
作者简介：张颖(1973)，女，硕士研究生，现任陕西省人民医院主治医师. Tel: 13772505999; Email: zhang_ying870@yahoo.com.cn
(西安交通大学：1. 第二医院心内科，陕西西安 710004；2.环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061；3. 医学院人体解剖学教研室，陕西西安710061)
(编辑 邱 芬)
收稿日期：20050120
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