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编号:11111564
先天性巨结肠与RET基因c135位点单核苷酸多态性相关性分析
http://www.100md.com 2005年10月1日 张宪生 周 莹 高 亚 徐 泉 段怡涛 郭新奎 李 鹏
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    参见附件(327KB，4页)。

     摘要：目的 确定国人陕西地区正常汉族人群中是否存在RET基因c135位点单核苷酸多态性及基因频率，研究先天性巨结肠患儿该位点基因型与表型的相关性，探讨其病因。方法 整体抽样随机选取40例陕西西安地区健康汉族献血者血样进行DNA抽提。对16例病理诊断证实为先天性巨结肠患儿狭窄段肠组织标本进行DNA提取(均为陕西地区患儿，汉族，散发性)。PCR扩增RET基因外显子2(含c135片段)，长度300bp，产物纯化后直接测序，并用相关软件及统计学分析。结果陕西地区正常汉族人群存在RET基因c135位点单核苷酸多态性A/G，A、G基因频率分别为0.475、0.525，各等位基因频率接近，G等位基因频率稍占优势。病例组16例A、G基因频率分别为0.844，0.156。病例组基因型以突变型AA(13/16)为主。对照组与病例组存在明显差异(P<0.001)。A等位基因与疾病关联强度OR＝5.97, OR95% CI(2.24,15.92)，OR值在0.05水平上有显著性。结论 国人陕西地区汉族人群RET位点存在单核苷酸多态性A/G，c135G>A。先天性巨结肠表型与该位点A基因型明显相关。RET基因c135位点单核苷酸多态性纯合突变型AA在先天性巨结肠患儿中过高表达。

    关键词：先天性巨结肠症；RET基因；单核苷酸多态性

    The relationship between Hirschsprung disease and single nucleotide

    polymorphisms of c135 in RET protooncogene

    Zhang Xiansheng, Zhou Ying, Gao Ya, Xu Quan1, Duan Yitao1, Guo Xinkui1, Li Peng

    (1. Department of Pediatric Surgery, Second Hospital of Xian jiaotong University, Xian 710004;2. Department of Pediatric Surgery, Xinhua Hospital, The Second Medical University, Shanghai 200092, China)

    ABSTRACT: Objective To make sure if there is single nucleotide polymorphisms(SNP) of c135 in RET protooncogene in Han ethnic group of Shaan Xi, China and investigate the relationship between Hirschsprung disease(HSCR) and SNP of RET protooncogene c135. Methods A total of 40 blood samples were collected from healthy donors through cluster sampling in Xian, Shaan Xi province. Sixteen tissues in aganglionic segments of HSCR were studied (they were all sporadic in Han ethnic group of Shaan Xi province of China and diagnosed by pathology). DNA was isolated from above samples and PCR amplified. The fragment of products were 300 case pairs (bp) which located in RET exon2 including c135. All of fragments were purified and directly sequenced and analyzed by related software and statistical methods. Results There really existed the single nucleotide polymorphisms of c135 A/G of RET in controls. A, G allele frequency was 0.475 and 0.525, respectively, and there was no distinctive dominant genotype. In patient group, A,G allele frequency was 0.844 and 0.156, respectively. c135A genotype was dominant in patients. There was significant statistical difference between patients and controls in RET c135A/G(P<0.001). By calculating odds ratios 5.97 and 95% Mantelhaenszel confident interval (2.24,15.92), it was concluded that there was relationship between the disease and the c135A genotype of RET. Conclusion Single nucleotide polymorphisms of c135 A/G of RET was confirmed in Han ethnic group in Shaan Xi. The allele frequency is c135G>A. There is relationship between the disease and the c135 A genotype of RET.c135A genotype in the RET protooncogene are overexpressed in patients with Hirschsprung disease.

    KEY WORDS:Hirschsprungs disease; RET protooncogene; single nucleotide polymorphisms

    先天性巨结肠(hirschsprungs disease, HSCR)是多基因多因素影响的遗传学疾病，连锁分析及相关研究显示RET是其主要致病基因，其ret蛋白功能丧失与先天性巨结肠有关。但HSCR中RET基因突变率低不足以解释ret功能丧失的结果，为此作为第三代遗传学标记的单核苷酸多态性(SNP)受到研究者的关注。国外近年研究显示RET基因c135位点SNP与散发性HSCR有很强的相关性\[1\]。SNP是指某一人群的正常基因组内特定核苷酸位置上存在不同碱基，且其最低的基因频率大于或等于1%，它被认为是一种稳定遗传的早期突变，基因组内多个SNP单体型的不同与疾病有着稳定的相关性。由于种族的不同，SNP的差异相当大，迄今为止所发现的SNP仅1/3适用于所有的种族\[2,3\]。目前我国大陆关于RET基因的SNP分布及与HSCR的关系研究仍是一个空白。本研究对陕西地区汉族人群RETc135位点是否存在SNP及与先天性巨结肠的相关性进行初步探讨。

     1 材料与方法

    1.1 样本选择

    整体抽样随机选取40例健康汉族人外周静脉血(西安地区某固定采血点陕西籍人群，经血检合格者，年龄18～47岁，女10例，男30例，男∶女＝3∶1，均为汉族，无相关疾病家族遗传史)，ACD抗凝，-20℃保存备用。16例HSCR患儿,均经病理诊断证实，汉族，散发性，不伴其他畸形或综合征，年龄 8d～ 1岁4月，男 13例，女3 例，男女比4.3∶1。全结肠型、长段型4例，常见型、短段型12例(采用佘亚雄小儿外科学中标准)。术中未输血或仅输红细胞悬液。结肠标本术中新鲜取材，无菌生理盐水冲洗，迅速液氮冷冻置-80℃冰箱备用。

    1.2 方法

    1.2.1 基因组DNA提取、鉴定

    对照血液标本行快速盐析法提取基因组DNA,肠组织标本采用组织基因组DNA提取试剂盒(广州中山医科大学达安基因股份有限公司)提取DNA。紫外分光光度计及10g/L(1%)琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性。

    1.2.2 PCR及产物鉴定

    ①对所有标本DNA行PCR扩增RET外显子2。引物依据文献\[4\]获得。引物序列Primer 1：5′CAGAAGCCATATTCTCACCA3′；Primer 2：5′AATCTCCCAGGAGCTATGGTCC3′。②反应体系50μL，终浓度dNTP 0.2mmol/L，引物0.6μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板400ng。反应条件：预变性94℃ 5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，终延伸72℃ 5min。③20g/L(2%)琼脂糖凝胶电泳，EB染色,紫外灯下观察到300bp条带为阳性目的片段。

    1.2.3 目的片段的纯化、回收及直接测序

    采用PCR产物胶回收试剂盒(上海华舜)进行目的片段的胶纯化回收。将回收产物用DNA测序仪直接测序(北京华大中生科技发展有限公司)。

    1.3 统计学处理

    采用病例对照研究方法进行统计分析：χ2检验分析病例与对照差异显著性；计算OR值及OR 95%可信区间(CI)进行关联分析及检验。

     2 结果

    40例对照及16例病例所有样品测序成功，峰图清晰结果可信，未发现目的片段可疑突变位点，c135位点附近测序结果见图1，表1。表1 国人陕西地区正常对照及先天性巨结肠病例组RET基因c135位点基因型及频率(略)

    陕西地区正常汉族人群存在RET基因c135位点单核苷酸多态性A/G，A、G基因频率分别为0.475、0.525，各等位基因频率接近，G等位基因频率稍占优势。病例组16例A、G基因频率分别为0.844，0.156。病例组基因型以突变型AA(13/16)为主。对照组与病例组存在明显差异(P<0.001)。A等位基因与疾病关联强度OR＝5.97, OR 95%CI(2.24,15.92)，OR值在0.05水平上有显著性。

     3 讨 论

    随着分子生物学及遗传学的发展，对HSCR病因认识不断深入。目前RET基因与先天性巨结肠发病关系最为密切。胚胎期RET信号通路的激活是肠神经系统祖细胞迁移定植的必要条件。RET基因敲除鼠可致肠道先天性神经节细胞缺如，与人类表型相似。然而RET突变仅在50%家族性HSCR和3%～15%散发性HSCR中检测出\[5\]。近年来第三代遗传标记SNP成为研究关注的热点。国外研究发现RET基因多个内含子和外显子的SNP在HSCR中过高或过低表达，与HSCR表型相关\[6,7\]。尤其RET基因c135A多态性在HSCR中过高表达与疾病关系密切。该位点在发病中的具体作用机制仍然不清。由于人种不同，可以影响SNP位点的位置及频率，我国大陆尚无RET基因SNP筛查研究基础资料公开报道。因此研究

    我国人群中RET基因SNP位点及频率非常必要。

    SNP是某一人群的正常基因组内特定核苷酸变异，它不同于高频率的突变，存在于编码区及紧邻上下游序列中的SNP可能改变基因的表达水平和表达产物，使蛋白质的结构和功能发生变化，直接导致疾病的易感性及对环境因子及药物的反应\[8\]。它可以解释人种和个体差异造成的疾病表型及患病率的不同。

    本研究样本和病例组性别比例基本匹配，为此性别差异造成的偏倚较小。由于男女性别比例差异大，女性数量偏少，故未作性别差异频率对比。国外资料显示性别间无显著差异。病例组采用抽提组织DNA研究SNP,主要考虑对患儿无需抽血，且取材便利，且理论上组织与血液标本DNA模板完全相同。经测序对照组突变型等位基因A频率为0.475>1%，故可推断国人陕西地区汉族人群中存在RET基因外显子2 c135G/A位点多态性，但各等位基因频率接近，G等位基因频率稍占优势。Genbank中LOCUS AF520975报道的该位点频率为A 0.78,G 0.22，研究人群为混杂正常欧洲人群。国外正常非HSCR白种人G等位基因频率在0.70～0.84之间\[1,7,9\]。分析造成频率差异的可能因素有抽样方式及人种、地域的差异，由于研究人群40例属小样本，结果亦可能存在一定偏倚，但影响最大的因素可能还是人种的不同。病例组该位点基因型绝大多数表现为纯合子A基因型13/16，与对照存在显著性差异(P<0.001)。A等位基因与疾病关联强度OR值为5.97,OR95%可信区间(2.24,15.92)不包含1，可认为该OR值在0.05水平上有显著性,说明A等位基因与HSCR发病存在显著关联。由于病例组样本含量偏小，统计分析结果可能会存在一定偏倚，因而我们没有分层分析深入探讨HSCR各表型发病与A等位基因相关性，但从总体研究结果分析与国外基本一致，深入扩大样本含量进行传递不平衡检验分析以及通过全RET基因SNP位点检测和从翻译转录水平的功能研究可能有助于进一步解释和探讨病因。

    总之，国人陕西地区汉族人群RET基因外显子2 c135位点存在SNP，先天性巨结肠与c135A等位基因存在相关性，RET基因c135位点SNP纯合突变型AA在先天性巨结肠患者中过高表达。详细机制有待深入研究。

     参考文献：

    [1\]Fitze G, Cramer J, Ziegler A, et al. Association between c135G/A genotype and RET protooncogene germline mutations and phenotype of Hirschsprung's disease \[J\]. Lancet, 2002, 359(9313):1200-1205.

    [2\]陆春叶.人类单核苷酸多态性及其应用 \[J\]. 国外医学遗传学分册, 2001, 24(1):21-24.

    [3\]张奎星，朱鼎良，黄薇. 多基因遗传病基因研究的策略和方法 \[J\]. 生理科学进展, 2001, 32(3):215-219.

    [4\]Attie T, Pelet A, Edery P, et al. Diversity of RET protooncogene mutations in familial and sporadic Hirschsprungs disease \[J\]. Hum Mol Genet, 1995, 4(8):1381-1386.

    [5\]Amiel J, Lyonnet S. Hirschsprung disease,associated syndromes, and genetics: a review \[J\]. J Med Genet, 2001, 38(1):729-739.

    [6\]McWhinney SR, Boru G, Binkley PK, et al. Intronic single nucleotide polymorphisms in the RET protooncogene are associated with a subset of apparently sporadic pheochromocytoma and may modulate age of onset \[J\]. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88(10):4911-4916.

    [7\]Borrego S, Ruiz A, Saez ME, et al. RET genotypes comprising specific haplotypes of polymorphic variants predispose to isolated Hirschsprung disease \[J\]. J Med Genet, 2000, 37(8):572-578.

    [8\]张效萌,韩金祥. 单核苷酸多态性的检测及其在医药领域的应用 \[J\]. 生命的化学, 2001, 21(4):325-327.

    [9\]Borrego S, Saez ME, Ruiz A, et al. Specific polymorphisms in the RET protooncogene are overrepresented in patients with Hirschsprung disease and may represent loci modifying phenotypic expression \[J\]. J Med Genet, 1999, 36(10):771-774.

    基金项目：西安市科委攻关项目(No. YG 200015)

    作者简介：张宪生(1948)，男(汉族)，主任医师，硕士研究生导师. 研究方向：先天性消化道畸形病因、矫治及小儿实体肿瘤. Tel: (029)88505908; Email: ZXS1024@sina.com

    (1. 西安交通大学第二医院小儿外科，陕西西安710004；2. 上海第二医科大学附属新华医院小儿外科，上海 200092)

    (编辑 邱芬)

    收稿日期：20041013

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