论文下载：人杀菌渗透增强性蛋白Ｎ末端片段在大肠杆菌中的表达

人杀菌渗透增强性蛋白Ｎ末端片段在大肠杆菌中的表达

http://www.100md.com 2006年2月1日董伟董晓慧楚雍烈杨娥胡刚郑建武

第1页

    参见附件(337KB，4页)。

     摘要：目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI) N端193个氨基酸的重组表达质粒，诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RTPCR的方法从HL60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列，克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193，转化大肠杆菌BL21菌株，用IPTG诱导表达蛋白。应用SDSPAGE检测蛋白表达情况，计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比；Westernblot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段，构建了TBPI193亚克隆和PETBPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导，经SDSPAGE检测表明，成功表达了6HisBPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Westernblot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PETBPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内，诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。

    关键词：杀菌/渗透增强性蛋白；基因表达；大肠杆菌

    Expression of human bactericidal/permeability increasing proteinNterminal fragment in E.coli

    Dong Wei, Dong Xiaohui, Chu Yonglie, Yang E, Hu Gang, Zheng Jianwu

    (Department of Immunology and Microbiology, Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

    ABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression plasmid of cDNA sequence encoding first 193 amino acids of BPI Nterminal and to express it in E.coli BL21. Methods Total RNA was extracted from HL60 cell and then was amplified by using RTPCR. The PCR product was cloned into pMD18T vector. BPI193 gene was directly cloned into PET28a plasmid on the role of T4 DNA ligase. PETBPI193 recombinant expression vector was transformed into competent E.coli BL21 and protein expression was induced by IPTG. Fusion protein was detected by SDSPAGE and Westernblot. Results A 579bp DNA amplicon was amplified by RTPCR. TBPI193 subclone and PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. 6HisBPI193 fusion protein containing 193 amino acids of BPI Nterminal was expressed by IPTG induced method. Fusion protein was detected by SDSPAGE and confirmed by Westernblot. The expressed fusion protein constituted 12% of total bacterial protein. Conclusion PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. To transform PETBPI193 recombinant plasmid into E.coli BL21 and 6HisBPI193 fusion protein was expressed by IPTG induced manner.

    KEY WORDS: bactericidal/permeability increasing protein; gene expression; E.coli

    迄今为止，对脂多糖引起的并发症，如内毒素血症与败血症休克仍没有有效的治疗手段，临床治疗急需新的抗革兰阴性(G-)菌感染的药物。人杀菌渗透增强性蛋白(bactericidal/permeability increasing protein ，BPI)是对细菌高度稳定的非催化蛋白，主要存在于人及哺乳动物多形核白细胞(PMN)的嗜天青颗粒中,也可微量表达于PMN和单核细胞表面\[13\]。最新研究表明，BPI还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞\[45\]，它不仅具有特异性杀伤G-菌的作用，还可以中和内毒素，是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”\[6\]。在本实验中，我们建立了稳定表达BPI氨基端(BPI193)的原核表达系统，获得了高产量的纯化蛋白，为进一步研究BPI在体内外的生物活性，研发新的BPI产品创造条件。

     1 材料与方法

    1.1 细胞株、菌种和质粒 HL60细胞株由第四军医大学微生物教研室雷迎峰博士惠赠；E.coli DH5α和E.coli BL21为本室保存菌株；pMD18T 载体为Takara公司产品；PET28a原核表达质粒为Novagen公司产品。

    1.2 主要试剂 Trizol为Invitrogen公司产品；cDNA第一链合成逆转录试剂盒购自Fermentas公司；XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4DNA连接酶均为Takara公司产品；DEPC为Sigma公司产品；DNTPs购自北京鼎国生物公司；小剂量质粒提取试剂盒和DL2000 DNA marker购自北京天为时代公司，小分子量蛋白marker购自华美公司；溃疡性结肠炎患者血清由西安交通大学医学院第二附属医院检验科李步荣医师惠赠；山羊抗人HRPIgG购自博士德生物公司；1640培养基购自Gibco公司；DNA凝胶回收试剂盒为北京赛百盛公司产品。

    1.3 引物的设计与合成根据GenBank数据库已收录的BPI cDNA的基因序列，借助于软件Primer Premier 5.0和DNA club设计了扩增BPI 1193个氨基酸的上下游扩增引物。

    P1 5′ CTGGATCCATGGTCAACCCTGGCGTCGT 3′(BamHⅠ)

    P2 5′ CCGCTCGAGTTACAGAGTCTGGAAATAAGG 3′(XhoⅠ)

    在引物的5′端分别添加了BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，以确保酶切后可以插入PET28a原核表达载体中，并且读码框正确，还添加了起始密码ATG和终止子TAA。扩增的BPI位于124-702bp，DNA长度为579bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

    1.4 方法

    1.4.1 RTPCR扩增目的基因用Trizol试剂从HL60细胞中提取总RNA，按试剂盒说明反转录出cDNA第一链，然后进行PCR扩增目的基因。经15g/L的琼脂糖凝胶电泳分析结果后，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。通过10g/L的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量。

    1.4.2 PCR产物与T载体的连接及鉴定按照pMD18T载体说明书，进行PCR回收产物和pMD18T载体的连接反应。将连接产物转化感受态E.coli DH5α，经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落，然后用PCR、限制性内切酶分析和DNA测序证实BPI193是否插入T载体以及基因序列有无突变。

    1.4.3 PETBPI193重组质粒的构建分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切TBPI193和原核表达载体PET28a，酶切产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，用北京赛百盛公司凝胶回收试剂盒回收，DNA定量后在T4DNA连接酶的作用下将BPI193定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193。转化大肠杆菌BL21菌株，筛选出阳性菌落，并采用PCR和限制性酶切技术鉴定，得到表达菌。

    1.4.4 目的蛋白的诱导表达和鉴定用IPTG诱导表达菌，采用不同的IPTG诱导浓度(1、2、3、4mmol/L)和诱导时间(1、2、3、4、5、6h)，应用SDSPAGE技术检测细菌蛋白表达情况，获得最佳表达条件，计算机薄层扫描分析表达目的蛋白占菌体总蛋白百分比。应用WesternBlot技术检测表达蛋白的特异性。

     2 结果

    2.1 RTPCR扩增结果 RTPCR反应后取5μL经15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出约602bp的基因片段，与预期大小相符。

    2.2 BPI193基因片段与T载体的连接将获得的BPI193基因片段RTPCR的产物凝胶回收后，按照pMD18T载体说明书操作，双酶切结果切出约585bp和2690bp左右的基因片段，与预期相符(图1)。送上海华诺公司测序，证明BPI193基因序列完全正确，命名为TBPI193。

    图1 重组质粒TBPI193的PCR、双酶切鉴定(略)

    Fig.1 Identification of plasmid TBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion

    1: DL2000 DNA marker; 2: BPI193 from PCR; 3: restriction enzyme digestion with BamHⅠ and XhoⅠ

    2.3 PETBPI193重组质粒的构建用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切TBPI193和PET28a质粒，凝胶回收试剂盒回收得到纯化产物。用T4连接酶连接，转化E.coli DH5α，卡那霉素筛选细菌，并进行PCR和BamHⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定，PCR扩增出约602bp的基因片段，双酶切获得约585bp和5329bp的基因片段，与预期相符(图2)。

    图2 PETBPI193重组质粒的PCR、酶切鉴定(略)

    Fig.2 Identification of recombinant plasmid PETBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion

    1: DL2000DNA marker; 2: PCR product of TBPI193; 3:PCR product of PETBPI193; 4: double restriction enzyme digestion with BamHⅠ and XhoⅠ

    2.4 BPI193重组蛋白的表达和鉴定用IPTG诱导表达菌BL21，发现随时间延长蛋白量有所增加，在4h时表达量较大。在不同IPTG浓度的条件下诱导蛋白表达， 2-3mmol/L时蛋白表达量比较丰富。诱导后在21ku左右处有蛋白表达，该蛋白大小与预期相符。经薄层扫描分析，表达蛋白量占菌体总量的12%左右。可溶性分析表明表达的BPI193重组蛋白以包涵体的形式释放(图3)。Westernblot鉴定，结果表明用IPTG诱导后的PETBPI193表达菌在相应约21ku位置出现特异性染色带，而未诱导的表达菌没有该条带(图4)，说明表达的目的蛋白具有特异性。

    图3 重组蛋白BPI193在IPTG诱导浓度不同时的表达情况(略)

    Fig.3 Expression of recombinant protein BPI193 at different inducer concentrations

    1: lower MW protein marker; 2: noninduced PETBPI193; 3-6: IPTG induced PETBPI193 at 1, 2, 3, 4mmol/L

    图4 重组蛋白BPI193的Westernblot鉴定(略)

    Fig.4 Identification of recombinant protein BPI193 by Westernblot

    1: noninduced PETBPI193; 2: induced PETBPI193

     3 讨论

    根据BPI氨基端的基因序列设计了1对特异性引物，采用RTPCR的方法从HL60细胞中成功扩增了602bp的基因片段，与预期的目的基因片段大小相符。将BPI193基因片段克隆入pMD18T载体，构建TBPI193重组质粒。转化E.coli DH5α，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，经PCR和限制性内切酶鉴定分析(BamHⅠ和XhoⅠ双酶切)，均获得了与预期相符的实验结果。经DNA测序分析，本实验获得的BPI193基因序列与文献报道完全一致，没有突变。

    PET28a为原核表达载体。将BPI193基因片段定向克隆入PET28a原核表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，初步筛选出阳性克隆后，通过菌落PCR以及BamHⅠ和XhoⅠ双酶切分析进一步鉴定，与预期结果相一致。最后再进行DNA测序分析，确证BPI193基因片段准确无误的正向插入到表达载体中，并且BPI193的N末端与6个组氨酸相连接。PETBPI193重组表达质粒构建成功。

    PETBPI193重组表达质粒转化表达菌E.coli BL21，经过IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的预期重组蛋白，其分子质量为21ku左右，并且可以与BPI抗体特异性结合，充分证明BPI193表达成功。

    传统制备BPI多采用柱层析的方法，国外获得BPI N端功能性片段多采用真核系统表达\[611\]，但这些方法生产条件要求比较高，消耗巨大，影响了临床应用。研究表明BPI糖基化部位与蛋白的活性没有显著关系，BPI是否糖基化对于抗体与抗原的识别来说没有明显影响\[12\]。本研究采用原核表达系统表达BPI193重组蛋白，大大降低了生产成本，为后续的实验研究奠定了基础。

    本研究选用PET28a作为原核表达载体，它含有T7启动子，是一种T7噬菌体表达系统，具有能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录基因的优点。其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点，可利用固化Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白，还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白，从而获得重组的目的蛋白。是一种较好的表达载体。

    为了获得最优化的蛋白表达条件，在IPTG终浓度为1mmol/L时延长表达时间，发现随时间延长蛋白量有所增加，但增长幅度不大，在4h时表达量较大。在不同IPTG浓度的条件下诱导蛋白表达，发现2-3mmol/L时蛋白表达量比较丰富。生长温度可能是影响大肠杆菌高水平表达的主要因素之一，通过试验确定最佳温度是表达外源蛋白的关键。本实验分别在加入IPTG后于37、35、33℃进行BPI193重组蛋白的诱导表达，虽然几种温度条件下融合蛋白都可以表达，但温度较低时蛋白表达量更加丰富，表达也比较稳定。

    BPI193基因片段被定向克隆于PET28a原核表达载体后，其N端与6个组氨酸形成融合蛋白，并在IPTG的诱导下得以表达。经蛋白的可溶性分析显示，BPI193与组氨酸融合蛋白在细菌中主要以包涵体的形式进行表达，而在细菌裂解液上清中没有检测到BPI193融合蛋白。虽然反复优化诱导表达条件，但BPI193重组蛋白总是以包涵体的形式存在。文献中也提示，几种利用原核表达系统表达人BPI时，目的蛋白也总是以包涵体的形式释放。我们推测可能与以下因素有关：①大肠杆菌BL21进入对数生长期时间短，生长速度快，由于细菌生长过度或者生长过速加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体；②BPI193是BPI N末端前193个氨基酸，包含了3个与生物活性密切相关的区域，具有完整BPI特异性杀伤GNB、结合及中和LPS的能力。大肠杆菌本身就是革兰阴性菌，因此对于E.coli BL21来说，BPI193重组蛋白具有细胞毒性，可能会对细菌产生杀伤作用。所以细菌在合成过程中将蛋白纳入包涵体中，消除或减弱蛋白的生物活性，减轻对宿主菌的毒性作用。BPI193重组蛋白以包涵体的形式存在有助于表达产物的分离和提取，也可以减少胞内蛋白酶对蛋白的破坏和降解。因此，在本实验中具有有利的方面。但是，要获得具有功能性的重组蛋白还需要进行复性处理，回复蛋白的空间结构和生物活性，这会给生产使用带来一些麻烦，有待进一步完善。

    虽然经过多种方法优化蛋白表达条件(包括延长诱导时间，增加诱导剂浓度，降低诱导时细菌培养温度)，但是BPI193融合蛋白的表达量仍然很低，经分析只占菌体总蛋白的12%左右。这可能是因为：①诱导条件没有达到最优，诱导前后细菌培养的条件不合适；②Bluow等\[13\]研究发现，完整的BPI以及含有BPI C端和LBP N端的嵌合体都可以稳定的储存在细胞中，而缺失了C端的BPI在储存过程中会被降解。所以，推测部分BPI193与组氨酸的融合蛋白在表达过程中可能被细菌降解。这尚需在今后的实验中进一步研究。

    参考文献：

    \[1\]Weersink AJ, van Kessel KP, van den Tol ME, et al. Human granulocytes express a 55kDa lipopolysaccharidebinding protein on the cell surface that is identical to the bactericidal/permeabilityincreasing protein \[J\]. J Immunol, 1993,150(1):253263.

    \[2\]Weiss J. Leucocytederived antimicrobial proteins \[J\]. Curr Opin Hematol, 1994,1(1):7884.

    \[3\]Calafat J, Janssen H, Knol EF, et al. The bactericidal/permeabilityincreasing protein (BPI) is membraneassociated in azurophil granules of human neutrophils, and relocation occurs upon cellular activation \[J\]. APMIS, 2000,108(3):201208.

    \[4\]Calafat J, Janssen H, Tool A, et al. The bactericidal/ permeabilityincreasing protein (BPI) is present in specific granules of human eosinophils \[J\]. Blood, 1998, 91(12):47704775.

    \[5\]Geraldine Canny, Ofer Levy, Glenn TF, et al. Lipid mediatorinduced expression of bactericidal permeabilityincreasing protein (BPI) in human mucosal epithelia \[J\]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(6):39023907.

    \[6\]Weiss J, Elsbach P, Olsson I, et al. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes \[J\]. J Bio Chem,1978,253(8):26642672.

    \[7\]Ooi CE, Weiss J, Elsbach P, et al. A 25 kDa NHzterminal fragment carries all the antibacterial activities of the human neutrophi1 60 kDa bactericidal/ permeabilityincreasing protein \[J\]. J Biol Chem, 1987, 262(31):1489114894.

    \[8\]Ooi CE, Weiss J, Doerfler ME, et al. Endotoxinneutralizing properties of the 25 kD Nterminal fragment and a newly isolated 30 kD Cterminal fragment of the 5560 kD bactericidal/permeabilityincreasing protein of human neutrophils \[J\]. J Exp Med, 1991,174(3):649655.

    \[9\]GazzanoSantoro H, Parent JB, Grinna L, et al. Highaffinity binding of the bactericidal/permeabilityincreasing protein and a recombinant aminoterminal fragment to the lipid A region of lipopolysaccharide \[J\]. Infect Immun, 1992, 60(11):47544761.

    \[10\]Weiss J, Elsbach P, Shu C, et al. Human bactericidal/ permeabilityincreasing protein and a recombinant NH2terminal fragment cause killing of serumresistant gramnegative bacteria in whole blood and inhibit tumor necrosis factor release induced by the bacteria \[J\]. J Clin Invest, 1992, 90(3):11221130.

    \[11\]Horwitz AH, Leigh SD, Abrahamson S, et al. Expression and characterization of cysteinemodified variants of an aminoterminal fragment of bactericidal/permeabilityincreasing protein \[J\]. Protein Expr Purif, 1996, 8(1):2840.

    \[12\]Schultz H, Csernok E, Johnston TW, et al. Use of native and recombinant bactericidal/permeabilityincreasing proteins (BPI) as antigens for detection of BPIANCA\[J\]. J Immunol Methods, 1997, 205(2):127133.

    \[13\]Bulow E, Gullberg U, Olsson I. Structural requirements for intracellular processing and sorting of bactericidal/permeabilityincreasing protein (BPI): comparison with lipopolysaccharidebinding protein \[J\]. J Leukoc Biol, 2000, 68(5):669678.

    (编辑卓选鹏)

    基金项目：陕西省科技攻关项目(No. 2002K10GI19)；陕西省卫生厅科研基金项目(No.02D38)

    通讯作者：董晓慧，女，教授. Email: dongxh@mail.xjtu.edu.cn

    作者简介：董伟(1976)，女(汉族)，硕士研究生. Email:dw424@163.com

    (西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系，环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061)

http://www.100md.com/html/paper/1671-8259/2006/01/03.htm

您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(337KB，4页)。