ｈＧＤＦ5基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响
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摘要：目的 探讨人生长分化因子5(hGDF5)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法 采用脂质体介导方法将hGDF5基因转入体外培养的兔BMSCs，用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)、间接免疫荧光检测hGDF5 mRNA和蛋白质的表达，并通过检测碱性磷酸酶活性、细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖(PG)的表达，分析转染hGDF5对BMSCs增殖、分化的影响。结果 hGDF5 mRNA及蛋白在基因转染细胞内得到正确表达；hGDF5基因转染组和对照组相比，ColⅡ、PG表达水平显著增高(P<0.01，P<0.01)，而碱性磷酸酶活性和细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论 外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hGDF5。高表达的hGDF5可以促进BMSCs向软骨表型分化，但对细胞增殖和碱性磷酸酶活性无明显影响。
关键词：生长分化因子5；骨髓间充质干细胞；基因转染；分化
Effects of human growth/differentiation factor 5 gene transfer on the proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in vitro
Ren Xiaoyong, Zhang Yingang, Chen Wenxian
(Department of Otorhinolaryngology, Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Xian Jiaotong University, Xian 710061;Department of Otorhinolaryngology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xian 710038, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of gene transfection with human growth/differentiation factor 5(hGDF5)on the differentiation and proliferation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Methods BMSCs were obtained from adult New zealand rabbits and purified by gradient centrifuge .Exogenous recombinant human GDF5 was transfected into BMSCs with liposome method. Then hGDF5 expression at mRNA and protein level was measured separately by reverse transcriptionpolymerase reaction and indirect immunofluorescence method. Activity of alkaline phosphates (ALP), expression of TypeⅡcollagen (ColⅡ), proteoglycan and growth of the cells were all measured by biological methods to evaluate the effects of hGDF5 gene transfer on the differentiation and proliferation of rabbit BMSCs. Results After hGDF5 gene transfection, BMSCs expressed hGDF5 mRNA and protein, and compared with the control groups, expression of proteoglycan and ColⅡ increased significantly, but no significant difference appeared in ALP activity and cell proliferation. Conclusion Gene transfer with hGDF5 is an effective way to enhance the expression of GDF5 at mRNA and protein. The expression of heterogenetic hGDF5 gene can induce BMSCs differentiation to chondrogenic cells.But the gene transfection has no obvious effects on the proliferation and ALP activity of BMSCs.
KEY WORDS:growth/differentiation factor 5 (GDF5); bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs); gene transfection; differentiation
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是来源于中胚层的未分化细胞，因其具有强大的自我更新能力和多向分化潜能在组织工程学领域受到人们的关注。大量研究证实，BMSCs在骨形态发生蛋白诱导下可以向成软骨或成骨分化，复合生物材料移植体内可以有效地促进组织缺损的修复。生长分化因子5(growth/differentiation factor 5, GDF5)是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)家族中与众不同的成员，是机体软骨形成、骨骼发育过程中重要的调节因子。其与细胞外基质复合移植皮下或肌肉中可以形成软骨或肌腱样组织，局部应用可以显著促进骨、软骨、肌腱、韧带损伤的修复，从而在组织工程方面展现出诱人的应用前景\[1\]。我们采用分子生物学手段将hGDF5基因体外转染兔BMSCs，初步观察转染后hGDF5的表达及其对干细胞增殖、分化的影响，为将来用于基因加强组织工程提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 pCA350hGDF5质粒(含hGDF5编码序列)、pcDNA3.1(+)载体由西安交通大学疾病相关基因教育部重点实验室许鹏博士惠赠；限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ购自美国New England Biolabs公司；脂质体、Trizol试剂盒为美国GibcoBRL公司产品；GDF5单克隆抗体购自美国R＆D公司；ColⅡ单克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司；免疫组化试剂盒及羊抗兔IgGFITC购自北京中山生物技术有限公司。酶联免疫检测仪系华东电子管厂生产；碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物制品公司。
1.2 pcDNA3.1(+)/hGDF5真核表达质粒的构建 登录GenBankNM 000557获Human GDF5 cDNA、对照目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)限制性内切酶谱，设计引物。引物5′端和3′端分别引入BamHⅠ、NotⅠ酶切位点，上游引物为5′GCTGTTCTGGATCCTGTCATTCAGGGGCTGGCC3′，下游引物为5′TATTCTTACGCCGGCGGCCAGTGCTGCTACCTGCAGC3′。以pCA350hGDF5质粒为模板扩增目的基因，PCR产物及pcDNA3.1(+)质粒分别经BamHⅠ、NotⅠ酶切，T4DNA 连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，进行酶切、测序鉴定，重组质粒命名为pcDNA3.1(+)/hGDF5。扩大培养碱裂法大量抽提重组质粒。
1.3 BMSCs的取材与培养 取健康新西兰大白兔(第四军医大学实验动物中心提供)6只，3月龄，体质量2.5-3.0kg，雌雄不拘。腹腔注射盐酸氯氨酮(50mg/kg)麻醉，严格消毒后，用20mL注射器(内含100U/mL肝素的5mL生理盐水)带16号针头自胫骨上端穿刺抽取骨髓，双侧共抽取5-6mL，LDMEM混匀，沿管壁加入含等量1.073g/mL percoll液的离心管中，1500r/min 离心25min，小口吸管缓慢吸取中间界面云雾状单个核细胞层， PBS 洗2 次，加入LDMEM完全培养基\[含10%(体积分数)FBS，青霉素钠100U/mL，链霉素100μg/mL\]。调节细胞密度至1×106/mL，接种于培养瓶内，置5%(体积分数)CO2、37℃饱和湿度培养箱。3d后首次换液，去除未贴壁细胞。此后每3、4d换液1次，至10-12d。细胞基本铺满单层，2.5g/L胰酶消化成单细胞悬液，以2×105/mL密度传代培养。
1.4 脂质体介导的hGDF5转染BMSCs 传代培养的BMSCs约60%融合时，用胰酶消化，接种于24孔培养板,分为hGDF5转染组、空载体转染组和未转染组。每组3复孔，每孔细胞数调节至2×106，加LDMEM培养基(含10%FCS,不含抗生素)；待细胞70%-80%融合时，用无血清DMEM培养基换液备用。DNA/脂质体混合物的配制：将60μL DAN质粒滴入灭菌离心管中，以3mol/L醋酸钠和无水乙醇沉淀，12000r/min离心1min后弃去上清液,用75%(体积分数)乙醇漂洗后再离心，吸去上清，用100μL灭菌三蒸水溶解DNA，加入60μL脂质体混匀，室温放置30min，加入无血清DMEM培养基。吸去培养基,按组相应加入上述混合物或单纯脂质体，0.3mL/孔。37℃放置4h，再加入足量的无血清DMEM培养基,继续培养12h。吸去培养上清后，加入含10%(体积分数)FBS的LDMEM培养基,常规培养。培养48h后用G418筛选至阳性克隆形成(约20d)，扩大培养用于检测指标。
1.5 转染后细胞GDF5表达的检测 取传代培养的转染细胞和对照细胞，按Trizol试剂盒说明提取总RNA。根据GenBank Human GDF5cDNA序列设计一对引物：上游引物5′CGAAGCGGGCCTTAATCT3′，下游引物5′CGTGGTCAGGAAGCAGAG3′(443bp)。以GAPPH为内参照,上游引物5′GCTTCACCACCTTCTTGATG3′；下游引物5′GTCAAGGCCGAGAATGGGAA3′(198bp)。采用QIAGEN OneStep RTPCR 试剂盒反应体系。RTPCR条件为：54℃ 30min, 95℃ 15min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，30 个循环，72℃ 延伸5min。1.5g/L琼脂凝胶电泳。另取上述各组细胞配制成细胞悬液,加鼠抗人GDF5单克隆抗体，37℃下孵育2h后，PBS冲洗，凉干。再用FITC标记的羊抗鼠IgG 37℃封闭30min，PBS漂洗，加入DAPI室温下孵育5min，甘油封片,荧光显微镜观察。
1.6 MTT比色法检测细胞增殖活性 取上述各组细胞制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×106/mL，接种于96孔培养板。第1、3、5、7、9日同一时点，每组随机选3孔，弃去培养液，加入20μL MTT(5g/L)，继续孵育4h后弃去上清,加入100μL DMSO，振荡混匀，室温下放置30min，在酶标仪490nm波长处测定各孔的吸光度(A)值，根据所测数值绘制细胞生长曲线。
1.7 碱性磷酸酶活性检测 取上述各组细胞制备单细胞悬液，以1×106/mL密度接种于96孔培养板，分别于第2、4、6、8、10、12日消化细胞，调成2×105/mL，取1mL加入等量0.1g/L TritonX100，振荡混匀，于4℃冰箱中过夜。反复吹打后,按碱性磷酸酶试剂盒操作步骤进行，570nm用酶标仪分光光度计测出其吸光度(A)值。
1.8 细胞外基质的检测 取上述各组细胞爬片(每组10张)，丙酮固定，行ColⅡ免疫组化检测及甲苯胺蓝染色。CMIAS真彩色医学图像分析系统测定染色的吸光度。200倍镜下切片随机选择3-5个阳性视野测量吸光度，取其均值代表该标本的蛋白表达强度。结果以(±s)表示。
1.9 统计学处理 应用SPSS12.0软件进行统计分析。不同组间ColⅡ免疫组化及甲苯胺蓝染色的吸光度比较采用最小显著差法，不同时点各组间碱性磷酸酶活性和增殖活力(A值)的比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA )。以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 重组真核表达质粒的鉴定 双酶切电泳图出现约5.3kb和1.5kb两条片断，单酶切电泳获6.8kb大小片断，和质粒载体及hGDF5cDNA预计值大小符合 (图1)。质粒经测序鉴定和GenBank hGDF5cDNA序列一致。
图1 PcDNA3.1(+)/hGDF5质粒酶切鉴定结果(略)
Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of PcDNA3.1(+)/hGDF5
1,3: pcDNA 3.1(+)/hGDF5cDNA digested by enzyme BamHⅠand NotⅠ; 2: pcDNA 3.1(+)/hGDF5cDNA digested by enzyme BamHⅠ; 4: marker
2.2 转染后hGDF5的表达 RTPCR结果显示，基因转染组出现约443bp大小电泳条带，而未转染组和空载体转染组则未出现(图2)。荧光显微镜下观察可见，hGDF5转染组爬片视野中可见胞浆中散在的绿色荧光，而空载体转染组和未转染组则仅显示DAPI标记的蓝色荧光 (图3) 。
图2 转染后BMSCs中hGDF5mRNA的表达(略)
Fig.2 Expression of hGDF5 mRNA in BMSCs after tranfection
1:marker; 2,3: BMSCs transfected with pcDNA3.1(+)/hGDF5cDNA; 4: BMSCs transfected with pcDNA3.1(+); 5: normal BMSCs
图3 免疫荧光检测BMSCs中hGDF5蛋白的表达(略)
Fig.3 Detection of hGDF5 expression by immunofluorescence
a: BMSCs transfected with pcDNA 3.1(+)/hGDF5; b:control cells
2.3 MTT法检测结果 MTT比色法检测结果显示， hGDF5基因转染组培养细胞约在第3天进入对数生长期，第6天进入平台期，第8-9天生长开始减慢，生长曲线和对照组基本相似。hGDF5基因转染组吸光度(A)值在各时点均高于空载体转染组和未转染组，但差异并无显著性(P=0.117，图4)。
2.4 碱性磷酸酶活性检测结果 碱性磷酸酶活性随时间延长，有逐渐上升趋势。hGDF5转染组、空载体转染组、未转染组在不同观察时点的吸光度无显著差异(P=0.273，图5)。
2.5 细胞外基质的检测结果 ColⅡ免疫组化结果显示，基因转染组细胞浆出现较明显的棕色颗粒，而对照组显色较弱(图6)。甲苯胺蓝染色显示，基因转染组细胞浆呈较深兰紫色，而对照组着色极弱(图7)。切片经计算机图像分析，基因转染组细胞Ⅱ型胶元表达(以积分吸光度表示，下同)和和对照组比较有显著差异(P=0.006，P=0.007)；基因转染组蛋白多糖(PG)表达(以积分吸光度表示，下同)和对照组比较有显著差异(P=0.006，P=0.009，表1)。
图4 转染hGDF5基因对BMSCs增殖活力的影响(MTT比色法)(略)
Fig.4 Effects of hGDF5 gene transfer on the proliferation of BMSCs
图5 转染hGDF5基因对BMSCs ALP活性的影响(略)
Fig.5 Effects of hGDF5 gene transfer on the ALP activity of BMSCs
表1 BMSCs细胞外基质染色的吸光度值(略)
Table 1 Immunohistochemical distribution of ColⅡ and PG in BMSCs by means of image analysis
图6 免疫组化检测BMSCs中ColⅡ的表达(略)
Fig.6 Detection of ColⅡ expression in BMSCs with immunohistochemistry (SABC ×200)
a: immunohistochemical staining of ColⅡ in BMSCs transfected with hGDF5 gene;
b:immunohistochemical staining of ColⅡ in control cells
图7 BMSCs中蛋白多糖的表达(略)
Fig.7 Detection of PG in BMSCs (Toludine staining ×200)
a: toludine blue staining in BMSCs transfected with hGDF5 gene; b: toludin blue staining in control cells
3 讨论
GDF5是机体软骨形成、骨骼发育的重要调节因子之一，其基因突变或缺失将导致严重的肢体畸形\[23\]。外源重组的GDF5因子和生物基质材料复合，移植于骨、软骨、肌健以及韧带缺损处，能显著提高组织的愈合速度和质量，但直接应用却存在着作用时间短、效价低以及反复使用费用昂贵等缺点，因此尝试把GDF5的基因治疗引入组织工程学领域成为人们关注的热点。我们采用脂质体介导的真核转染技术将外源hGDF5基因转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞，经RTPCR、免疫荧光检测表明转染基因在mRNA和蛋白水平得到了较为稳定的表达，为进一步进行GDF5基因组织工程研究奠定了基础。
为了证实外源基因产物对BMSCs生物行为的影响，我们对BMSCs细胞外基质的表达水平进行了检测分析。结果表明，hGDF5基因转染组细胞合成细胞外基质的能力增强，ColⅡ和PG表达水平与对照组比较均显著上调,提示hGDF5有诱导BMSCs向软骨表型分化的作用。有关GDF5在机体软骨形成发育中的作用一直受到人们的重视。Coleman\[4\] 通过将外源GDF5转染鸡胚间充质细胞，使其过度表达，发现在软骨形成初期GDF5主要是促进间质细胞的黏附、聚集和软骨分化，后期则表现为显著促进软骨的成熟和肥大。Bai等\[5\]将GDF5和TGFβ结合在体外可以诱导间充质干细胞向软骨分化。除此之外，GDF5诱导骨膜细胞、成纤维细胞向软骨分化的作用也已经被体外实验所证实\[67\]。Gruber\[7\]还对GDF5等对骨髓间充质干细胞的影响做了进一步观察，发现它可以促进BMSCs前Ⅱ型胶元A表达上调，但却没有软骨成熟胶元前Ⅱ型胶元B表达的迹象。我们通过脂质体将外源hGDF5基因成功转入BMSCs,其基因蛋白表现出良好的促进干细胞软骨分化的生物活性，为应用该手段构造工程化软骨以及用于体内修复软骨缺损提供了实验依据。
碱性磷酸酶活性是反映BMSCs分化的一个重要指标。目前对GDF5调节碱性磷酸酶活性的作用并不完全清楚。Gruber\[7\]研究认为，在无血清培养条件下GDF5可以促进骨髓干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达升高，使细胞表现出成骨活性，并呈现出剂量依赖性，但这种作用和BMP其他成员(BMP6和BMP7)相比要弱得多。Koch等\[8\]观察了外源重组GDF5作用下BMSCs成骨相关基因mRNA以及碱性磷酸酶活性的动态变化，结果发现，ColⅠ基因和Runx2基因表达先上调随后很快降低，并低于对照组，而Osterix基因始终未见表达；细胞的碱性磷酸酶活性在实验组和对照组之间并无明显不同。我们观察了外源基因hGDF5表达对BMSCs的碱性磷酸酶活性的影响，结果显示，各组细胞随着时间的延长碱性磷酸酶活性呈现出增高趋势，但在不同时点各组之间并无显著差别。体外培养过程中细胞碱性磷酸酶活性的增高，可能在一定程度上受到了培养基成分(如胎牛血清)的影响。另外，我们通过MTT比色法检测了基因转染对细胞增殖力的影响，结果显示，在各个观察时点，hGDF5基因转染组细胞增殖活力和对照组相比有一定程度的增高，但差异无统计学意义。表明hGDF5基因转染并未引起BMSCs的过度增殖或抑制，较好地保持了细胞原有的生长状态。
由于外源hGDF5基因转染BMSCs可以获得具有生物活性的GDF5蛋白的表达，并在体外表现出良好的成软骨诱导作用，加上BMSCs本身来源丰富、取材方便、增殖能力强等优点，将转染GDF5基因的BMSCs和细胞外基质材料相结合构造工程化软骨，或自体移植修复软骨缺损无疑具有广阔的发展前景。
参考文献：
\[1\]Spiro RC, Liu L, Heidaran MA, et al. Inductive activity of recombinant human growth and differentiation factor5 \[J\]. Biochem Soc Trans, 2000,28(4):362368.
\[2\]Nakamura K, Shirai T, Morishita S, et al. p38 mitogenactivated protein kinase functionally contributes to chondrogenesis induced by growth/differentiation factor5 in ATDC5 cells \[J\]. Exp Cell Res,1999,250(2):351363.
\[3\]Takahara M, Harada M, Guan D,et al. Developmental failure of phalanges in the absence of growth/differentiation factor 5 \[J\]. Bone, 2004,35(5):10691076.
\[4\]Coleman CM, Tuan RS. Functional role of growth/differentiation factor 5 in chondrogenesis of limb mesenchymal cells \[J\]. Mech Dev,2003,120(7):823836.
\[5\]Bai X, Xiao Z, Pan Y, et al. Cartilagederived morphogenetic protein1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes \[J\]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 325(2):453460.
\[6\]尹烁,崔磊,李纲,等. CDMP1诱导成纤维细胞向称软骨细胞表型分化的实验研究 \[J\]. 上海第二医科大学学报,2004,24(4):254257.
\[7\]Gruber R, Mayer C, Bobacz K, et al. Effects of cartilagederived morphogenetic proteins and osteogenic protein1 on osteochondrogenic differentiation of periosteumderived cells \[J\]. Endocrinology, 2001,142(5):20872094.
\[8\]Koch H, Jadlowiec JA, Fu FH, et al. The effect of growth/differentiation factor5 (GDF5) on genotype and phenotype in human adult mesenchymal stem cells \[J\]. Z Orthop Ihre Grenzgeb, 2004,142(2):248253.
(编辑 卓选鹏)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30400163)
作者简介：任晓勇(1970),男(汉族)，医学博士. 研究方向：喉气管狭窄的临床与基础研究. Email: renxiaoyong@sina.com
(西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉科，陕西西安 710004；西安交通大学环境与疾病相关
基因教育部重点实验室，陕西西安 710061；第四军医大学唐都医院耳鼻咽喉科，陕西西安 710038)
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