大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验
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摘要：目的 建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系，进行骨向分化诱导，并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法 用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果 用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论 成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系，MSCs能够向成骨细胞分化，骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。
关键词：骨髓间充质干细胞；细胞培养；骨向分化；钛网；组织工程
An experimental study of osteogenic differentiation and inducted in vitro of SD rat bone marrow stem cell
Yao Tianhua, Li Xiaohong, Xiong Xizhou, Rao Guozhou, Shi Jianfeng, Li Ang
(Department of Research Center for Stomatology, Stomatological Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)
ABSTRACT: Objective To establish an isolation and culture system of rat bone marrow stem cells(MSCs), osteogenic differentiation and compound titanium meshes in vitro in order to verify their osteogenesis. Methods Density gradient centrifugation was used to isolate bone MSCs from SD rats and their morphological characteristics were examined under microscope. The bone MSCs underwent osteogenic induction and cytochemical and immunocytochemical staining were performed to verify their multipotential. Cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes were detected by scanning electron microscope. Results High purity of bone MSCs was successfully obtained and they showed good proliferation ability. Both ALP activity and mineraliztion node staining were positive in bone MSCs after osteogenic differentiation. Cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes were detected by scanning electron microscope, it was deposited calcified matrix. Conclusion The isolation and culture system of rat bone MSCs was successfully established and the bone MSCs sustained their osteogenic differentiation potential in vitro. The cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes was deposited calcified matrix.
KEY WORDS: bone marrow stem cells; cell culture; osteogenic differentiation; titanium meshes; tissue engineering
骨髓间充质干细胞(marrow stem cells, MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞类型，不但能增殖，在特定培养条件下还能实现跨系统分化。大量实验表明在体外可分化为成骨细胞、成软骨细胞等组织细胞[1]。由于其取材方便，易于体外分离培养扩增，且自体获取回输后不会发生免疫排斥反应，基因转染效率高，转染后稳定表达，因此骨髓MSCs被认为是组织工程和基因工程的重要种子细胞。本研究在总结以往研究的基础上，紧密结合临床，探索有关骨髓MSCs诱导分化为成骨细胞和钛网复合成骨细胞体外成骨，旨在探讨成骨细胞钛网移植物成骨的可行性。
1 材料与方法
1.1 主要材料及实验仪器 SD大鼠(西安交通大学医学院动物实验中心)、LG(低糖)DMEM培养液(GIBCO)、胎牛血清(FBS)(GIBCO)、地塞米松(GIBCO)、β甘油磷酸钠(GIBCO)、抗坏血酸(GIBCO)、胰蛋白酶(1∶300)(GIBCO)、1.077×103g/L淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)、商用纯钛网(西北有色金属研究所)、JSM840型扫描电镜(西安交通大学医学院电镜室)。
1.2 骨髓MSCs体外分离和培养 取4周龄SD大鼠，无菌条件下取出胫骨和股骨，剪去骨骺端，用LGDMEM培养液冲出骨髓，离心收集细胞。将细胞制成细胞悬液，加入含等量淋巴细胞分离液的试管中，以800g×30min离心，吸取界面白膜层细胞，培养液清洗，1.0×108/L接种于培养瓶中，37℃，50mL/L CO2的培养箱内培养。4d后更换培养液，以后每周换液2次。10-14d后待细胞达到70%-80%融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，传代。
1.3 骨髓MSCs诱导 取第三代骨髓MSCs，按5×107 /L的细胞密度制备细胞爬片，培养3d贴壁后进行诱导。骨向诱导液为含10%(体积分数)FBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，1×10-7mol/L地塞米松，10mmol/L β甘油磷酸钠，50μg/L抗坏血酸的LGDMEM培养液。每4d换液一次，共诱导2周。
1.4 鉴定 碱性磷酸酶(ALP)染色： 采用钙钴法ALP染色。分别选取骨向诱导1、2周的骨髓MSCs爬片，PBS洗涤后进行染色，显微镜下观察照相，黑染细胞为阳性细胞。以未诱导的细胞作为对照。VonKossa染色：分别选取骨向诱导1、2周的骨髓MSCs爬片行VonKossa染色，黑色的部位即为矿化结节。以未诱导的细胞作为对照。
1.5 钛网的制备 将商用纯钛网制成厚1mm﹑直径8mm的圆盘形薄片，320#耐水砂纸打磨光滑，75%(体积分数)乙醇清洗，三蒸水清洗3遍，高温高压消毒备用。
1.6 钛网与成骨细胞复合物的体外成骨 取两块6孔培养板，各加入1片钛网，将第3代骨髓MSCs消化制成均匀的细胞悬液，使其细胞浓度为4×107/L，接种6孔作为阴性对照组；将骨向诱导14d后的第3代骨髓MSCs消化制成均匀的细胞悬液，使其细胞浓度为4×107/L，接种6孔作为实验组，每孔分别加入2mL LGDMEM培养液，37℃，50mL/L CO2孵箱内培养。
1.7 扫描电镜(SEM)观察钛网表面矿化情况 分别在培养的7d和14d，取实验组、阴性对照组和阳性对照组各3孔，吸去原液，0.01mol/L PBS清洗3遍，2.5%(体积分数)戊二醛前固定，1%(体积分数)OsO4 后固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，离子溅射仪喷金，SEM观察钛网表面矿化的情况。
2 结果
2.1 细胞形态学观察 骨髓MSCs原代细胞4d时，多数细胞已贴壁，细胞以小角形、梭形多见，胞核位于中央，细胞间夹杂少量有核的淋巴细胞，红细胞极少见。第一次换液后，细胞为典型的长梭形，并呈集落生长，平行状或旋涡状排列，有一定的极性。传代以后，细胞以长梭形、多角形细胞为主，可见1-3个核仁，其中扁平的多角形细胞内细胞骨架结构清晰可见，杂质细胞极少见。一般10-14d便可达70%-80%融合(图1)，进行传代。诱导生成的成骨细胞由骨髓MSCs的纺锤形或梭形变为立方形﹑三角形、多角形，细胞数目多时可以叠层生长。
图1 MSCs原代培养12d，细胞呈梭形、多角形(略)
Fig.1 The primary cultured MSCs for 12 days, cells appear polygonal or spindlelike shape(×100)
2.2 钙钴法碱性磷酸酶染色结果 骨髓MSCs在骨向诱导7d后，部分细胞表现为ALP染色阳性，胞浆红染，细胞界限清楚(图2a)；而未经诱导的对照骨髓MSCs,则表现为阴性表达或弱阳性表达。骨髓MSCs经骨向诱导14d，多数细胞表现为ALP染色强阳性，胞浆呈均匀浅灰色，出现棕黑色颗粒，细胞界限清楚(图2b)；而未经诱导的对照组细胞无明显变化，表现为弱阳性。
2.3 VonKossa染色结果 骨髓MSCs经骨向诱导7d，可见少量细胞呈簇状生长，未见明显的细颗粒状结构(图3a)。经骨向诱导14d，可见细胞呈密集重叠生长，无接触抑制性。细胞外基质出现较多散在致密圆形或不规则形态的细颗粒状结节，无细胞结构，结节周围的细胞密度较高，轮廓不清，结节中心透光性差。经AgNO3染色呈黑色，证实为矿化结节，周围细胞也可轻微红染，细胞核红色(图3b)。而未经诱导的对照组细胞虽密集重叠生长，但不形成矿化结节，表现为阴性。
2.4 钛网复合成骨细胞复合物的体外矿化情况 扫描电镜结果显示，实验组在培养7d时钛网表面未见明显细颗粒状结构(图4a)，在培养14d时钛网表面可见许多大小不一、形态不规则的颗粒状结节(图4b)。阴性对照组在培养7d和14d时钛网表面未见明显改变。
图2 MSCs骨向诱导后的碱性磷酸酶表达(略)
Fig.2 The expression of alkaline phosphatase after the MSCs osteogenic inducted (Gomori staining ×40)
a: positive cells staining results of ALPase for 7 days
b: more positive cells staining results of ALPase for 14 days
图3 矿化结节形成(略)
Fig.3 The formation of calcified colliculus (VonKossa staining ×40)
a: unseen obvious granule constitution after osteogenic inducted for 7 days;
b: positive staining of scattered and compact calcified colliculus in ECM after osteogenic inducted for 14 days
图4 SEM观察钛网复合成骨细胞体外矿化(略)
Fig.4 Detected the cells of osteogenic differentiation that compounded titanium meshes by SEM(×200)
a: unseen obvious changes after osteogenic inducted for 7 days
b: calcified matrix deposited after osteogenic inducted for 14 days
3 讨论
骨髓MSCs具有向成骨细胞分化的潜能，且自体获取回输后不会发生免疫排斥反应，易于体外分离培养扩增，在体外可长时间保持未分化状态，加上骨髓来源丰富，采集方便安全、损伤小，将其作为理想的种子细胞用于创伤﹑感染﹑肿瘤及其他原因造成的骨组织缺损的研究已成为当前研究的热点。
由于骨髓MSCs在骨髓中的含量较低，每105个有核细胞中含有一个骨髓MSCs，并随着年龄的增大逐渐减少。目前对骨髓MSCs的分离、纯化、培养还没有统一的方法。密度梯度离心法[2]是比较常用的方法之一，是根据骨髓中不同细胞的密度不同，利用淋巴细胞分离液提取单个核细胞进行培养。因其分离细胞纯度较高，能有效地将骨髓中绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去，获得纯度较高的单个核细胞，且操作较为简单而被本研究应用。本研究用密度为1.077×103g/L的淋巴细胞分离液，成功的从骨髓中分离出高纯度的骨髓MSCs，杂质细胞少，细胞活力强，增殖速度快，经体外培养，原代细胞可形成形态均一的细胞增殖集落，并能稳定传代，保持其多向分化潜能的特性。
骨髓MSCs作为骨组织工程的种子细胞，首先应具备向成骨细胞分化的能力，而ALP活性和矿化结节形成是检测成骨细胞活性的特异性方法。本研究中应用的骨向诱导剂为地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸。地塞米松可以促进成骨细胞分化成熟，提高ALP活性，调节成骨细胞分泌胰岛素样生长因子(IGFs)，促进细胞外基质胶原合成。抗坏血酸可以促进培养的细胞合成Ⅰ型胶原，形成钙化，并调节ATP、ALP活性和非胶原基质蛋白的合成。β甘油磷酸钠为成骨细胞功能活动提高磷酸根离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化。资料显示：未诱导的骨髓MSCs组织化学显示ALP阴性或弱阳性，阳性率未及5%，VonKossa染色阴性[3]。骨髓MSCs骨向诱导3d后细胞ALP活性即明显增强，阳性率达到30%以上，1周后几乎所有细胞具有ALP活性，约培养10d，部分细胞呈聚集生长，逐渐形成VonKossa阳性的骨结节。本实验中骨髓MSCs在骨向诱导2周后ALP染色呈强阳性，有明显的矿化结节形成。说明骨髓MSCs具有良好的向成骨细胞定向分化的能力，可以作为骨组织工程的种子细胞。另外本实验中骨髓MSCs骨向诱导后，未出现资料中所示的1周后几乎所有骨髓MSCs具有ALP活性。可能的原因有：细胞虽经纯化，但仍有部分混杂细胞；应用骨向诱导剂的浓度仍需选择；骨向诱导的培养环境尚需调整等。
纯钛及钛合金因为它们具有与骨组织相匹配的硬度和弹性模量、良好的生物相容性、优秀的机械性能以及抗腐蚀能力，更重要的是它能与骨组织形成良好的“骨结合”，被广泛应用于目前临床的骨缺损修复、牙种植体等[4]，非常适合作骨组织工程支架。本实验采用纯钛网为支架材料，为骨髓MSCs的附着、生长、繁殖、新陈代谢、形成新组织提供支持。
Dolder等[5]通过对各种在钛网上接种或载入细胞的方法研究表明，钛网适于支持骨髓细胞成骨的表达。本实验以纯钛网为支架材料，经骨向诱导的骨髓MSCs为种子细胞，制备细胞钛网复合物，并成功的在体外成骨。
组织工程的目标是为了应用于临床，本实验将钛网复合成骨细胞移植物体外成骨，不仅为组织工程应用于颌面部骨缺损提供了实验依据，而且为其他部位及其他支架材料的构建提供了一条思路，为临床组织工程技术的研究提供了理论依据，也为骨组织工程的种子细胞应用于骨缺损的治疗奠定了基础。
参考文献：
[1]Lee HS, Huang GT, Chiang H, et al. Multipotential mesenchymal stem cells from femoral bone marrow near the site of osteonecrosis [J]. Stem Cells, 2003, 21(2):190199.
[2]Oswald J, Boxberger S, Jorgensen B, et al. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro [J]. Stem Cells, 2004, 22(3):377384.
[3]杨志明. 组织工程 [M]. 北京：化学工业出版社·现代生物技术与医药科技出版中心, 2002:128129.
[4]张永刚，潘可风. 钛种植体骨性结合的研究 [J]. 上海铁道大学学报(医学版), 1997, 11(增):7478.
[5]Van den Dolder J, Edward F, Paul HM, et al. Bone tissue reconstruction using titanium mesh combined with rat bone marrow stromal cells [J]. Biomaterials, 2003, 24:17451750.
(编辑 邱 芬)
(西安交通大学口腔医院，口腔医学研究中心，陕西西安 710004)
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