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大黄素和黄芪多糖对大鼠实验性肝癌的抑制作用

http://www.100md.com 2006年6月1日党双锁张正国袁利超王宝峰张欣宋平程延安

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    参见附件(287KB，4页)。

     摘要：目的研究大黄素与黄芪多糖对大鼠实验性肝癌的抑制作用并探讨其机制。方法采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱发大鼠肝癌模型。50只清洁级雄性SD大鼠随机分为5组：正常对照组、肝癌模型组(DEN诱癌)、大黄素组(诱癌同时给大黄素)、黄芪多糖组(诱癌同时给黄芪多糖)、大黄素和黄芪多糖联合给药组(诱癌同时联合用大黄素和黄芪多糖干预)，每组10只。联合灌胃14周。实验第18周处死所有大鼠，检测血清ALT、ALP、γGT和AFU，并行肝脏病理检查，用SABC法检测谷胱甘肽S转移酶(GSTP)、转化生长因子β1(TGFβ1)的表达情况。结果造模各组大鼠的ALT、ALP、γGT、AFU均明显升高(P<0.05)，两种药物干预可以减轻肝脏损害(P<0.05)。病理检查证实各实验组大鼠均诱发出肝癌。两种药物均能减少GSTP和TGFβ1的表达(P<0.05)，但联合应用未显示明显的协同作用。结论大黄素、黄芪多糖干预治疗可以减轻肝损害，降低肝癌标志物GSTP的表达。抑癌作用可能与这两种药物抑制了肝癌组织TGFβ1的表达有关。

     关键词：大黄素；黄芪多糖；肝癌

    Effects of emodin and astragalus polysaccharides on the expressions of GSTP and TGFβ1 in rats hepatocellular carcinoma constitution

    Dang Shuangsuo, Zhang Zhengguo, Yuan Lichao, Wang Baofeng, Zhang Xin, Song Ping , Chen Yanan

    (Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; Department of Infectious Diseases, ChineseJapanese Friendship Hospital, Beijing 100029, China)

    ABSTRACT: Objective To study the inhibiting effect of emodin and astragalus polysaccharides on experimental hepatocarcinoma in rats and to explore its possible mechanism. Methods Hepatocarcinogenesis model rat was induced by diethylnitrosamine (DEN). Fifty SD male rats were randomly divided into 5 groups: normal control group, hepatocarcinogenesis model group(induced by DEN), emodin group, astragalus polysaccharides group, combined emodin with astragalus polysaccharides group. Rats were administered with emodin and astragalus polysaccharides when they were induced by DEN. All rats were killed in the 18th week, Then serum ALT, ALP, γGT, αLfucoxidase (AFU) was detected. All rats livers were observed by routine histological. GSTP and TGFβ1 were tested with SABC. Results The results of liver function in the 18th week displayed that ALT, ALP, γGT and AFU of all groups were increased than that of negative control (P<0.05). The two drugs could relieve hepatic injures. 88% of rats were induced to hepatocellular carcinoma confirmed by HE staining. The expressions of GSTP and TGFβ1 in normal control were higher than that in groups which used emodin and astragalus polysaccharides(P<0.05). Conclusion Emodin and astragalus polysaccharides can relieve hepatic injure and inhibit the expression of GSTP and TGFβ1. The inhibiting effect on TGFβ1 may be one of the mechanisms to control hepatocarcinoma.

    KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatocellular carcinoma

    原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，病情发展迅速，药物治疗是重要的治疗手段。大黄素、黄芪多糖是分别从中药大黄和黄芪中提取的有效成分。研究表明大黄素对乳腺癌细胞、肺癌细胞等多种肿瘤发生和发展有一定抑制作用[1]，黄芪多糖能够通过增强宿主免疫反应发挥抗肿瘤作用。本实验通过观察单独与联合应用这两种药物对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的作用，证实大黄素、黄芪多糖对肝细胞癌有一定的抑制作用，并推测它们对肝癌组织TGFβ1表达的抑制可能是它们抑癌作用的机制之一。

     1 材料与方法

    1.1 药品与仪器二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)，纯度>0.99g/mL，Sigma公司产品，临用前配成2g/L DEN溶液；大黄素，纯度>95%，购自西安崇信天然添加剂有限公司，临用前配成8g/L大黄素混悬液。黄芪多糖，纯度>65%，购自西安鸿生生物技术有限公司，临用前配成80g/L水溶液；GSTP，多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，临用前按1∶50比例稀释；TGFβ1，多克隆抗体，购自武汉博士德生物公司，临用前按1∶50比例稀释；SABC试剂盒，购自武汉博士德生物公司。日立7170型全自动生化分析仪。

    1.2 实验动物及分组清洁级雄性SD大鼠50只，3-4月龄，体重(351.2±19.8)g，购自西安交通大学实验动物中心。所有动物分笼饲养于我校实验动物房，适应环境3d。全部大鼠随机分为5组：正常对照组(仅给等量生理盐水)、肝癌模型组(DEN诱癌)、大黄素组(诱癌同时给予大黄素)、黄芪多糖组(诱癌同时给予黄芪多糖)、大黄素和黄芪多糖联合给药组(诱癌同时联合用大黄素和黄芪多糖干预)，每组10只大鼠。

    1.3 给药方法除正常对照组外，其余各组均给予DEN灌胃(10mg/kg)，每周5次，至14周停药。同时大黄素组按40mg/kg给予大黄素混悬液灌胃；黄芪多糖组按200mg/kg给予黄芪多糖液灌胃；大黄素和黄芪多糖联合给药组给予大黄素和黄芪多糖联合给药，剂量同大黄素组和黄芪多糖组。正常对照组给予等量生理盐水灌胃，至14周停药。各组给药方法及间隔均同DEN。

    1.4 取材及固定实验第18周，用200g/L乌拉坦腹腔注射麻醉各组大鼠。从腹主动脉取血6mL，离心(3000r/min，2min)取血清，于-20℃冰箱内冻存。动物处死后均剖开腹腔，剪取整个肝脏，记录一般情况及表面癌结节数，称肝重。统一取结节处、结节周围及远离结节处共3块标本，均为1cm×1cm×1cm大小，较好的标本照相留存，全部标本在10%(体积分数)甲醛溶液中固定24h。

    1.5 组织病理检查固定后送至病理科行脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋，制备成5μm厚的切片，HE染色，常规组织学检查。

    1.6 免疫组化染色均采用SABC法[2]。GSTP检测步骤为：①石蜡切片脱蜡至水。②3%(体积分数)H2O2室温孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min。③100mL/L正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min。④倾去血清，滴加1∶100稀释的一抗，4℃过夜。PBS冲洗，5min×3次。⑤滴加生物素标记的二抗，37℃ 30min。PBS冲洗，5min×3次。⑥滴加适当比例稀释辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min。PBS冲洗，5min×3次。⑦DAB显色。⑧自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，中性树胶封片。TGFβ1检测时在第2步后行微波抗原修复，其余步骤和GSTP相同。两种因子检测时均用PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.7 免疫组化染色结果判断以显微镜测微尺10×10方格表，每一切片随机选择5个视野，每一表计算5个小方格的细胞数，阳性细胞浆内有棕色颗粒。阳性细胞百分比=[阳性细胞数/(5个小方格细胞数×20)]×100%，计算5个视野百分率的平均数。根据细胞显色程度及阳性比例分为(-)：细胞不着色，与背景一致，记0分；(+)：细胞浆呈浅棕色，阳性细胞<30%，记1分；()：细胞浆呈棕色，阳性细胞占30%-70%，记2分；()：细胞浆呈深棕色，阳性细胞>70%，记3分。

    1.8 统计学处理计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析进行检验，等级资料采用秩和检验。结果采用统计软件SPSS11.0进行处理。

     2 结果

    2.1 实验动物一般情况正常对照组大鼠进食、饮水好，喜活动，背毛柔顺、有光泽，无死亡。肝癌模型组、大黄素组和黄芪多糖组大鼠从实验第8周以后进食量开始下降，联合给药组第10周始食量下降。大黄素组和黄芪多糖组各死亡2只，肝癌模型组与联合给药组各死亡1只。实验第18周，除正常对照组，其余各组大鼠全部诱发出肝癌。

    2.2 肝功检查结果实验第18周肝功测定结果显示：与正常对照组比较，其余各组大鼠的ALT、ALP、γGT、AFU均明显升高(P<0.05)。肝癌模型组各项指标升高最为显著，与联合给药组比较具有显著性差异(P<0.05)，但和大黄素组、黄芪多糖组比较无显著性差异(P>0.05，表1)。

    表1 各组大鼠肝功测定结果(略)

    Table 1 Hepatic function of different groups

    *P<0.05 vs. control; △P<0.05 vs. model

    2.3 病理改变巨检发现：正常对照组大鼠肝脏表面光滑，色淡红，边缘锐利，质地中等。其余各组大鼠肝脏表面均散在大小不等的白色结节，质地较硬。其中联合给药组大鼠结节数较其余各组有所减少，且结节直径较小。肝癌模型组、大黄素组和黄芪多糖组大鼠结节大小无明显差异，部分肝脏表面有单个较大的结节出现。

    HE染色：镜下见正常对照组大鼠除1例自发性肝癌外，其余大鼠肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，细胞核清晰。其他各组大鼠均诱发出肝癌，正常肝小叶结构被破坏。肝癌模型组肝癌分级多为Ⅲ级，大黄素组和黄芪多糖组多为Ⅱ-Ⅲ级，联合给药组多为Ⅰ-Ⅱ级，癌细胞分化程度较高(图1)。

    2.4 GSTP和TGFβ1表达

    2.4.1 GSTP表达正常对照组未见GSTP阳性表达。其余各组均可见呈棕黄色圆形、椭圆或不规则形、染色均匀、边界清楚的GSTP阳性灶。阳性反应主要在细胞浆内，有少数散在的细胞核也呈阳性反应。阳性细胞在组织内呈散在分布或灶性集聚(图2)。检测结果见表2，经统计学检验，肝癌模型组GSTP的表达高于大黄素组、黄芪多糖组、联合给药组(P<0.05)，而大黄素组、黄芪多糖组、联合给药组3组间并无显著性差异(P>0.05)。

    表2 大鼠肝组织GSTP检测结果(略)

    Table 2 Score of GSTP in all groups

    Rank sum test between(2),(3),(4),(5), χ2=8.221, P<0.05;

    rank sum test between(3),(4),(5), χ2=0.141, P>0.05

    2.4.2 TGFβ1表达正常对照组大鼠肝细胞呈TGFβ1阴性表达，在汇管区血管内皮细胞可见少量TGFβ1阳性表达。其余各组均可见TGFβ1阳性灶(图3)，癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGFβ1阳性表达，癌结节之间纤维间隔内也见TGFβ1阳性灶。检测结果见表3。经统计学检验，肝癌模型组TGFβ1的表达高于大黄素组、黄芪多糖组和联合给药组(P<0.05)；而大黄素组、黄芪多糖组和联合给药组3组间并无显著性差异(P>0.05)。

    表3 大鼠TGFβ1检测结果比较(略)

    Table 3 Score of TGFβ1 in all groups

    Rank sum test between(2),(3),(4),(5)，χ2=8.709，P<0.05；

    rank sum test between(3),(4),(5)，χ2=0.126，P>0.05

    图1 联合给药组大鼠肝细胞癌，Ⅰ级(略)

    Fig.1 Hepatocellular carcinoma induced in combined emodin with astragalus polysaccharides grade Ⅰ(HE ×200)

    图2 大黄素组大鼠肝癌组织GSTP阳性(略)

    Fig.2 Hepatoma tissue of emodin group positively expressed GSTP (SABC ×200)

    图3 肝癌模型组大鼠肝癌组织TGFβ1阳性(略)

    Fig.3 Hepatoma tissue of model group expressed TGFβ1 (SABC ×400)

     3 讨论

    DEN所含的亚硝胺基团具有中毒剂和诱癌剂的双重效应，利用DEN诱发的大鼠肝癌模型，诱癌方法简单，且多为肝细胞癌，诱癌成功率高。本实验给予大鼠DEN灌胃共14周，最后经病理证实全部诱发出肝癌，造模效果满意。

    αL岩藻糖苷酶是广泛存在于人体细胞、血液中的一种溶酶体酸性水解酶，肝细胞癌患者血清中AFU的活性明显高于继发性肝癌和肝硬化，在AFP阴性肝癌和小肝癌患者血清中AFU阳性率分别为76.1%和70.8%[3]。本研究中所有诱癌组大鼠血清AFU均明显高于正常对照组，而给予药物干预的大黄素组、黄芪多糖组和联合给药组AFU水平明显低于肝癌模型组水平。说明大黄素、黄芪多糖干预后可以降低诱癌大鼠血清AFU水平，对大鼠肝癌的形成具有一定的抑制作用。

    GSTP为一组二聚体蛋白，广泛分布于人体组织，与体内生物转化作用及肿瘤的发生关系密切[4]。在化学致癌物质诱发的肝癌增生结节或癌前病变的肝脏中，该酶的活性可增高数倍。肝GSTP阳性灶作为肝癌癌前病变的标志物已广泛应用于致癌剂的短期或中期筛选实验。在本实验中GSTP检测结果显示，所有诱癌组大鼠均可见GSTP阳性灶，并且给予药物干预的大黄素组、黄芪多糖组和联合给药组GSTP的表达明显低于单纯诱癌的肝癌模型组，提示大黄素、黄芪多糖可以抑制大鼠肝癌形成过程中GSTP的表达。

    作为细胞生长、分化的重要调控因子，TGFβ通过调节细胞周期因子、转录因子、生长因子、粘附分子和细胞基质基因的启动、转录、降解等环节而实现其促进或抑制细胞生长的功能[5]。TGFβ1是TGFβ家族中的重要成员。目前研究证实TGFβ1在原发性肝癌中表达异常增高，有利于肿瘤细胞的浸润转移[6]。本研究结果提示大黄素、黄芪多糖下调TGFβ1的表达可能是其抑制肝癌作用的机制之一。

    本实验基于大黄素的抗肿瘤特性及黄芪多糖的免疫调节作用，观察单独与联合应用两种药物对肝癌的抑制作用。结果显示单用大黄素能有效改善肝脏血清指标，降低GSTP 与TGFβ1表达，对大鼠实验性肝癌的形成有一定的抑制作用。黄芪多糖干预也能减轻肝损害，抑制GSTP、TGFβ1的表达，发挥抑癌作用。下调TGFβ1表达可能是两种药物共同的抑癌机制之一。联合应用大黄素、黄芪多糖组肝癌组织的GSTP和TGFβ1表达与单用两种药物组相比较其疗效并未见明显提高。我们考虑可能与药物剂量偏低，作用时间过短，样本量少等因素有一定的关系。对于大黄素、黄芪多糖两药是否具有协同作用，我们仍会改进实验方法进一步观察。大黄素和黄芪多糖干预并不能完全阻断肝癌的发生，其详细的抑制肝癌的机制还有待于更深一步的研究。

     参考文献：

    [1]Lee HZ, Hsu SL, Liu MC, et al. Effects and mechanisms of aloeemodin on cell death in human lung squamous cell carcinoma [J]. Eur J Pharmacol, 2001, 431(3):287295.

    [2]党双锁. 医学常用实验技术精编 [M]. 西安：世界图书出版社，2004:43.

    [3]Wang JJ, Cao EH. Rapid kinetic rate assay of the serum alphaLfucosidase in patients with hepatocellular carcinoma by using a novel substrate [J]. Clin Chim Acta, 2004, 347(12):103109.

    [4]Higashi K, Hiai H, Higashi T, et al. Regulatory mechanism of glutathione Stransferase Pform during chemical hepatocarcinogenesis: old wine in a new bottle [J]. Cancer Lett, 2004, 209: 15563.

    [5]Musch A, Rabe C, Paik MD, et al. Altered Expression of TGFbeta receptors in hepatocellular carcinoma  effects of a constitutively active TGFbeta type I receptor mutant [J]. Digestion, 2005, 71: 7891.

    [6]Park DY, Sol MY, Suh KS, et al. Expressions of transforming growth factor (TGF)beta1 and TGFbeta type II receptor and their relationship with apoptosis during chemical hepatocarcinogenesis in rats [J]. Hepatol Res, 2003, 27(3):205213.

    (编辑邱芬)

    基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30472266)

    (西安交通大学医学院第二附属医院感染科，陕西西安 710004；中日友好医院感染科，北京 100029)

http://www.100md.com/html/paper/1671-8259/2006/03/13.htm

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