赵烨,葛凡,李子航,朱景天,薛梅

    (1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院,江苏 南京 210023)

    糖尿病是一种终身代谢性疾病,由多种原因引起,其特征是慢性的高血糖,已知并发症最多。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病发展过程中常见且难治性的微血管并发症[1]。大量临床数据都表明肾间质纤维化是DN肾损伤的重要环节[2]。目前研究证实,肾脏纤维化调控机制涉及多条信号转导通路,其中关注度较高的致纤维化因子是转化生长因子(TGF)-β,而参与肾脏纤维化的因子主要以TGF-β1为主。TGF-β1信号传导包括Smads家族中Smad2和Smad3,在大量肝脏、肾脏以及心脏纤维化研究中,TGF-β1/Smad3信号通路发挥重要作用[3]。有研究表明,miR-27a通过影响肾纤维化、线粒体功能障碍和内质网应激参与DN[4]。体外研究发现miR-27a可通过靶向抑制PPARγ而诱导NRK-52E细胞纤维化,其机制可能与TGF-β1/Smad3通路的激活有关[5]。

    当归补血汤是由黄芪和当归以5∶1组成的中医经典方剂,已传承数千年,是主治气血虚发热症的基础要方[6]。药理学研究证实当归补血汤可通过提高机体免疫、改善肾脏组织慢性缺氧状态、调节血管活性物质及细胞因子、抑制高糖下肾组织IRE1α/JNK等通路的表达、减轻高糖下肾脏的内质网应激反应、调控巨噬细胞自噬等机制而发挥对DN的治疗作用[7-9],本课题组前期证明当归补血汤主要吸收成分对GK大鼠具有保护作用,但机制尚不清楚[10]。因此,本研究通过高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)纤维化,观察当归补血汤含药血清对HK-2细胞纤维化的作用,深入研究miR-27a对糖尿病肾纤维化的作用机制。

    1 材料

    1.1 药物与试剂

    HK-2购自中国典型培养物保藏中心;黄芪(北京同仁堂,批号:190919001);当归(北京同仁堂,批号:259200103);DMEM/F12(美国GIBCO公司,批号:8119395);胎牛血清(美国GIBCO公司,批号:2275129);D-葡萄糖水合物(上海源叶生物科技有限公司,批号:S18F11H108777);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司,批号:102511693028);MTT(德国Biofroxx公司,批号:EZ2811F232);miRNA 1st Strand cDNA Synthesis kit(南京诺唯赞生物科技有限公司,批号:7E480H0);miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司,批号:7E421E0);Smad3-siRNA、con-siRNA、miR-27a-inhibitor、miR-27a-inhibitor negative control(加拿大Applied Biological Materials公司,批号:K21C15MA、K21C15ME、EW8552、EW8552);DNAfectinTMPlus Transfection Reagent、RNAifectinTMTransfection Reagent(加拿大Applied Biological Materials公司,批号:69170008、0155844840003);TGF-β1(美国Proteintech Group公司,批号:0332307MG28);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术公司,批号:P0012A);β-肌动蛋白(β-actin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、Ⅳ型胶原(COL Ⅳ)抗体、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、Smad3抗体和TGF-β1抗体(美国Proteintech Group公司,批号:10004156、00098013、000083456、000086138、10004985、10011066);p-Smad3抗体(美国Affinity Biosciences公司,批号:7019561);PVDF膜(美国Millipore公司,批号:R0EB70106) ......