癫痫灵颗粒对戊四唑致痫大鼠C-fos蛋白及热休克蛋白-70表达的影响
摘要：目的观察痴痫灵颗粒对戊四唑致痈大鼠脑内C-fos及热休克蛋白-70(hsp-70)含量的影响。方法随机将72只大鼠分力6组，通过与阳性药物组及模型组的比较，研究癫痫灵颗粒抗癫痫作用的机制。结果：研究表明癫痫灵颗粒可显著减轻大鼠癫痫发作，可使戊四唑致痛大鼠的大脑中减少C-fos蛋白释放，降低hsp-70在大鼠脑内的表达。结论：癫痫灵颗粒具有良好的抗癫痫效果，可减轻大鼠癫痫发作对大脑的损伤。
关键词：癫痫灵颗粒，C-fos，蛋白；热休克蛋白-70
中图分类号：R392.5 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)09-0827-02
本实验通过观察戊四唑(PTZ)致痫大鼠脑内C-fos蛋白及热休克蛋白-70(hsp-70)含量的变化，探讨癫痫灵颗粒对戊四唑致痫大鼠抗癫痫的作用机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重200g±12g，黑龙汀中医药大学提供。
1.2 药物、试剂与仪器戊四唑，使用前2 h用生理盐水配制；癫痫灵颗粒(组方：天麻、钩藤、石决明、柴胡、天竹黄、磁石、生龙骨、甘草等)，由黑龙江中医研究院制剂室提供；卡马西平由上海第六制药厂提供，一抗由博士德生物工程有限公司提供，二抗由中杉生物工程有限公司提供；轮转式组织切片机，徕佧2135型，德国，研究用生物显微镜，OLYMPUSBX60，日本；CMIAS系列数码医学图像分析系统，Motic Med 6.0，中国。
1.3 方法72只大鼠随机均分为6组，每组12只，分别为空白组、模型组、卡马西平对照组、癫痫灵高剂量组、癫痫灵中剂量组、癫痫灵低剂量组。其中空白组、模型组予饲双蒸水2 mL/d，卡马西平对照组组予卡马西平9 mg/(kg·d)，癫痫灵组高、中、低剂量组浓度按9:3:1配制，分别饲药14 d。第15天除空白组外均予戊四唑50 mg/kg腹腔注射，对大鼠进行行为学观察，于1 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏，升主动脉插管，以生理盐水250 mL和含体积分数为25%的戊二醛、20 g/L多聚甲醛的0.1mol/L PBS固定后，断头活杀，迅速取出全脑，沿脑正中矢状切开，取一半大脑于相同固定液中固定24 h(4℃)，次日以40/μm厚度进行冷冻切片，行连续冠状切片，检测皮质内C-fos蛋白及hsp-70。
, 百拇医药
1.4 观察项目参考Racme癫痫发作分级标准观察观察大鼠癫痫发作分级并记录，运用CMIAS系列数码医学图像与分析系统记录各组C-fos蛋白及hsp-70阳性细胞密度。
1.5 大鼠惊厥发作评分标准 参考Racme癫痫发作分级标准，0级：无反应；Ⅰ级：节律性嘴和面部抽动；Ⅱ级：点头或甩尾；Ⅲ级：单肢抽动；Ⅳ级：多肢抽动和强直；Ⅴ级：全面性强直阵挛发作。
1.6 统计学处理运用SPSS10.0软件处理数据结果。
2 结 果
2.1 大鼠行为学观察。
2.2 C-fos蛋白及hsp-70含量
3 讨 论
癫痫的病因病机十分复杂，中医学认为其归属于痫证范畴。其病因有先后天之分，而又强调七情为患。传统认为风阳痰浊蒙蔽心窍，流窜经络，是造成痫证发作的基本病理因素。对癫痫单纯部分性发作多从肝风夹痰论治，本证型的临床特征是发作时意识尚清，或突然神呆，两目凝视，可见手足抽动，或见烦渴、自汗、颜面潮红、腹痛吐泻、妄听妄视等种种见证，多伴有面色苍白、倦怠乏力、纳呆、大便秘结或溏泄、舌苔自腻、脉弦滑等肝风夹痰的临床表现。而癫痫灵颗粒组方中天麻、钩藤、石决明平肝熄风，柴胡疏肝解郁、推陈致新，天竹黄化痰定惊，生龙骨、磁石潜阳安神，甘草调和诸药。全方共奏平肝潜阳、镇静安神之功。
, http://www.100md.com
本实验中选择了戊四唑致病大鼠模型，它是目前应用较多的大鼠癫痫模型之一，PTZ是中枢神经系统兴奋剂，功能减弱可使神经元过度兴奋，引起癫痫发作。正常对照研究表明，腹腔给予PTZ(50 mg/kg)后1 min-2 mm即可引起动物Ⅱ级癫痫发作，且发作频繁，可持续1 h以上。这个模型类似于癫痫单纯部分性发作。
神经递质受体信号通过细胞内第二信使系统可以直接引起一些基因的转录，也可以迅速激活某些调节基因，并表达出相应的调节蛋白质，再通过这些调节蛋白选择性结合于有关DNA，引起另一些基因(次级靶基因)的表达，从而较长时间地改变神经元的结构和功能，产生生物学效应。现已证明C-fos，C-jun等即属这类调节基因。它们在神经冲动、神经递质、激素等外界刺激信号传人的数分钟内即可作出反应进行表达。这些基因表达的调节蛋白也称核内第三信使。它们在其信息传递过程中起着重要作用。神经元兴奋可导致C-fos蛋白快速、大量、一过性表达，因此，C-fos蛋白的表达可作为细胞水平神经元兴奋的特异性标记物。用免疫组织化方法显示C-fos蛋白是目前使用的机能形态学方法之一。有研究发现C-fos基因存在于哺乳动物的神经细胞核内，在神经系统痫性活动情况下可被快速诱导，从而导致神经元的可塑性变化和效应基因表达的永久性改变。对突变体癫痫易感小鼠研究发现，在癫痫发作期间C-fos基因显著表达，同时在小鼠大脑海马CA1区和顶叶皮质能检测到细胞DNA的断裂，认为伴随癫痫的发作有C-fos基因转录产物C-fos蛋白所诱发的激活作用的级联反应，它在凋亡最初的激活和最后的失活过程中导致了DNA的断裂，参与了癫痫病灶的形成。
, 百拇医药
而hsp-70是机体在遭受各种刺激后，诱导产生的一组应激蛋白。hsp-70是热休克蛋白中最保守和最主要的一类，在细胞应激后生成最为显著，被认为对神经元损伤具有保护作用。当神经元受损时，hsp-70表达后分别在胞浆和胞核中同变性蛋白结合，防止变性蛋白进一步折叠，促使其恢复或加速其降解和消除，维持神经元内蛋白自稳，以维护细胞的功能和生存。目前，神经元受损时，hsp-70表达对受损神经元的保护作用已基本肯定，因此,hsp-70在脑内表达的速度及数量在一定程度上影响神经元对癫痫兴奋性损伤的耐受性，并可能是癫痫脑内神经元选择性脱失的内在机制之一。
本实验中癫痫灵颗粒对戊四唑致痫大鼠大脑C-fos蛋白及hsp-70的合成有明显抑制作用，能够显著控制癫痫发作，减轻神经元在癫痫发作时的兴奋性损伤。对其具体作用途径尚有待进一步研究。
本文编辑 王雅洁, 百拇医药(王 顺 刘 军 蔡玉颖 王威岩)
关键词：癫痫灵颗粒，C-fos，蛋白；热休克蛋白-70
中图分类号：R392.5 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)09-0827-02
本实验通过观察戊四唑(PTZ)致痫大鼠脑内C-fos蛋白及热休克蛋白-70(hsp-70)含量的变化，探讨癫痫灵颗粒对戊四唑致痫大鼠抗癫痫的作用机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重200g±12g，黑龙汀中医药大学提供。
1.2 药物、试剂与仪器戊四唑，使用前2 h用生理盐水配制；癫痫灵颗粒(组方：天麻、钩藤、石决明、柴胡、天竹黄、磁石、生龙骨、甘草等)，由黑龙江中医研究院制剂室提供；卡马西平由上海第六制药厂提供，一抗由博士德生物工程有限公司提供，二抗由中杉生物工程有限公司提供；轮转式组织切片机，徕佧2135型，德国，研究用生物显微镜，OLYMPUSBX60，日本；CMIAS系列数码医学图像分析系统，Motic Med 6.0，中国。
1.3 方法72只大鼠随机均分为6组，每组12只，分别为空白组、模型组、卡马西平对照组、癫痫灵高剂量组、癫痫灵中剂量组、癫痫灵低剂量组。其中空白组、模型组予饲双蒸水2 mL/d，卡马西平对照组组予卡马西平9 mg/(kg·d)，癫痫灵组高、中、低剂量组浓度按9:3:1配制，分别饲药14 d。第15天除空白组外均予戊四唑50 mg/kg腹腔注射，对大鼠进行行为学观察，于1 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏，升主动脉插管，以生理盐水250 mL和含体积分数为25%的戊二醛、20 g/L多聚甲醛的0.1mol/L PBS固定后，断头活杀，迅速取出全脑，沿脑正中矢状切开，取一半大脑于相同固定液中固定24 h(4℃)，次日以40/μm厚度进行冷冻切片，行连续冠状切片，检测皮质内C-fos蛋白及hsp-70。
, 百拇医药
1.4 观察项目参考Racme癫痫发作分级标准观察观察大鼠癫痫发作分级并记录，运用CMIAS系列数码医学图像与分析系统记录各组C-fos蛋白及hsp-70阳性细胞密度。
1.5 大鼠惊厥发作评分标准 参考Racme癫痫发作分级标准，0级：无反应；Ⅰ级：节律性嘴和面部抽动；Ⅱ级：点头或甩尾；Ⅲ级：单肢抽动；Ⅳ级：多肢抽动和强直；Ⅴ级：全面性强直阵挛发作。
1.6 统计学处理运用SPSS10.0软件处理数据结果。
2 结 果
2.1 大鼠行为学观察。
2.2 C-fos蛋白及hsp-70含量
3 讨 论
癫痫的病因病机十分复杂，中医学认为其归属于痫证范畴。其病因有先后天之分，而又强调七情为患。传统认为风阳痰浊蒙蔽心窍，流窜经络，是造成痫证发作的基本病理因素。对癫痫单纯部分性发作多从肝风夹痰论治，本证型的临床特征是发作时意识尚清，或突然神呆，两目凝视，可见手足抽动，或见烦渴、自汗、颜面潮红、腹痛吐泻、妄听妄视等种种见证，多伴有面色苍白、倦怠乏力、纳呆、大便秘结或溏泄、舌苔自腻、脉弦滑等肝风夹痰的临床表现。而癫痫灵颗粒组方中天麻、钩藤、石决明平肝熄风，柴胡疏肝解郁、推陈致新，天竹黄化痰定惊，生龙骨、磁石潜阳安神，甘草调和诸药。全方共奏平肝潜阳、镇静安神之功。
, http://www.100md.com
本实验中选择了戊四唑致病大鼠模型，它是目前应用较多的大鼠癫痫模型之一，PTZ是中枢神经系统兴奋剂，功能减弱可使神经元过度兴奋，引起癫痫发作。正常对照研究表明，腹腔给予PTZ(50 mg/kg)后1 min-2 mm即可引起动物Ⅱ级癫痫发作，且发作频繁，可持续1 h以上。这个模型类似于癫痫单纯部分性发作。
神经递质受体信号通过细胞内第二信使系统可以直接引起一些基因的转录，也可以迅速激活某些调节基因，并表达出相应的调节蛋白质，再通过这些调节蛋白选择性结合于有关DNA，引起另一些基因(次级靶基因)的表达，从而较长时间地改变神经元的结构和功能，产生生物学效应。现已证明C-fos，C-jun等即属这类调节基因。它们在神经冲动、神经递质、激素等外界刺激信号传人的数分钟内即可作出反应进行表达。这些基因表达的调节蛋白也称核内第三信使。它们在其信息传递过程中起着重要作用。神经元兴奋可导致C-fos蛋白快速、大量、一过性表达，因此，C-fos蛋白的表达可作为细胞水平神经元兴奋的特异性标记物。用免疫组织化方法显示C-fos蛋白是目前使用的机能形态学方法之一。有研究发现C-fos基因存在于哺乳动物的神经细胞核内，在神经系统痫性活动情况下可被快速诱导，从而导致神经元的可塑性变化和效应基因表达的永久性改变。对突变体癫痫易感小鼠研究发现，在癫痫发作期间C-fos基因显著表达，同时在小鼠大脑海马CA1区和顶叶皮质能检测到细胞DNA的断裂，认为伴随癫痫的发作有C-fos基因转录产物C-fos蛋白所诱发的激活作用的级联反应，它在凋亡最初的激活和最后的失活过程中导致了DNA的断裂，参与了癫痫病灶的形成。
, 百拇医药
而hsp-70是机体在遭受各种刺激后，诱导产生的一组应激蛋白。hsp-70是热休克蛋白中最保守和最主要的一类，在细胞应激后生成最为显著，被认为对神经元损伤具有保护作用。当神经元受损时，hsp-70表达后分别在胞浆和胞核中同变性蛋白结合，防止变性蛋白进一步折叠，促使其恢复或加速其降解和消除，维持神经元内蛋白自稳，以维护细胞的功能和生存。目前，神经元受损时，hsp-70表达对受损神经元的保护作用已基本肯定，因此,hsp-70在脑内表达的速度及数量在一定程度上影响神经元对癫痫兴奋性损伤的耐受性，并可能是癫痫脑内神经元选择性脱失的内在机制之一。
本实验中癫痫灵颗粒对戊四唑致痫大鼠大脑C-fos蛋白及hsp-70的合成有明显抑制作用，能够显著控制癫痫发作，减轻神经元在癫痫发作时的兴奋性损伤。对其具体作用途径尚有待进一步研究。
本文编辑 王雅洁, 百拇医药(王 顺 刘 军 蔡玉颖 王威岩)