舒冠滴丸对动脉粥样硬化兔CD40通路调节作用研究(1)
摘要：目的 观察舒冠滴丸对动脉粥样硬化斑块CD40通路的调节作用。方法 运用高脂高胆固醇饲料造成兔动脉粥样硬化模型，随机分成模型组、舒冠滴丸组、辛伐他汀组，另设空白对照组。采用酶联免疫吸附法测定血浆可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)浓度。然后，提取AS兔主动脉和心脏进行病理组织形态学观察。结果 舒冠滴丸组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著低于模型组(P<0.01)，舒冠滴丸组血浆sCD40L，sICAM-1水平明显降低，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)，而血浆sVCAM-1水平无统计学意义；病理组织形态学观察，舒冠滴丸组主动脉AS斑块明显少于模型组(P<0.05)，冠状动脉AS斑块各组差异无统计学意义(P>0.05)：舒冠滴丸组內膜病变较模型组明显减轻，其內膜厚度、內膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比亦较模型组显著减少(P<0.01)。结论 舒冠滴丸具有调节血脂紊乱，减少动脉內膜斑块数量，消退和稳定AS斑块，降低血浆sCD40L，sICAM-1水平，其作用可能与抑制AS斑块炎症反应有关。
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关键词：舒冠滴丸；动脉粥样硬化；细胞间黏附分子-1；细胞黏附分子-1：兔
中图分类号：R543.5 R285.6 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)10-0958-03
近年来，越来越多的证据表明炎症在不稳定动脉粥样硬化(AS)斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要的作用。CD40-CD40L作为重要的炎症信号通路，它的主要生物学效应之一是促进炎症介质如血管黏附分子的释放。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达增加可促进AS的慢性炎症过程，同时增加AS斑块的不稳定性，加快斑块裂隙，促进斑块破裂、血栓形成。因此，检测外周血可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性ICAM-1(sICAM-1)和可溶性VCAM-1(sVCAM-1)浓度可反映AS斑块的炎症程度和稳定性状况。舒冠滴丸是在古方心救汤(《石室秘录》)基础上，结合多年临床经验研制的防治冠心病心绞痛的有效验方，是以冰片、鹅不食草、三七、白芥子、肉桂、公丁香、红参等为主要组成部分，功能芳香通脉、益气温阳、豁痰化瘀。本研究通过构建兔动脉粥样硬化模型，观察舒冠滴丸对AS斑块CD40通路的调节作用，探讨其抗动脉粥样硬化的可能作用机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级健康日本雄性大耳白兔44只，平均体重2.0 ks(1.9 ks～2.5kg)，由湖南中医药大学实验动物中心提供。医学实验动物合格证：医动字第20～003号。饲养条件：单笼分装，室温(25±2)℃，相对湿度65%±5%，实验前动物在实验饲养房内适应性喂养1周。实验环境设施合格证号：医动字第20-001号。
1.2 实验药物 舒冠滴丸每粒50 mg，由湖南中医药大学附一院药剂科提供，批号：20001030。舒降之片(辛伐他汀，每片20mg)，由默沙东制药有限公司提供，批号：20020530。
1.3 主要试剂、仪器 胆固醇粉(分析纯，每瓶25 g，荷兰进口上海试剂站分装)，猪油(市售)，蛋黄粉(陕西天斗蛋业有限公司提供)；sCD40L试剂盒(奥地利Bender MedSysterns公司提供)sICAM-1，sVCAM-1试剂盒(法国DIACLONE公司提供)，LD-A5型离心机(北京医用离心机厂生产)，CL-7200全自动生化分析仪(日本岛津公司)，721分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)，TP-1000电子天平(湘仪天平仪器厂生产)，DG-3022A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管制造厂制造)。
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1.4 兔动脉粥样硬化模型的建立及分组 将44只实验动物随机分成4组：空白组(8只)、模型组(12只)、舒冠滴丸组(12只)、辛伐他汀组(12只)。以上各组除空白组只给予标准全价营养饲料外，其余各组均每天每只给予高脂饲料100 g(含1.0 g胆固醇、7.5 g蛋黄粉、5.0 g猪油、86.5 g标准全价营养饲料)喂养8周，8周后随机抽取高脂饲料喂养兔2只处死，取胸主动脉标本制作病理切片以证实产生粥样硬化斑块。动脉粥样硬化模型造模成功后，舒冠滴丸组每只每日按人一兔等效量给药[50mg/(kg·d)]，辛伐他汀组每只每日喂服辛伐他汀药液[2.5mg/(kg·d)]，空白组、模型组灌饲蒸馏水10 mL，每组均给药4周，均于上午给食前灌胃。所有动物自由饮水，继续喂养4周。最终取得完整资料者进入分析，共28只，其中舒冠滴丸组7只。辛伐他汀组7只，模型组6只，空白对照组8只。
1.5 指标检测方法
1.5.1 标本处理 各组均于12周后分别从兔颈动脉收集血样(5～6)mL，注入10 mL肝素抗凝离心管，摇匀，3 500 r/min离心3 min，取上清血浆置于-70℃保存待测sCD40L，sICAM-1，sVCAM-1。同时测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
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1.5.2 血浆sCD40L，sICAM-1，sVCAM-1的检测 采用酶联免疫吸附法测定血浆sCD40L，其检测灵敏度为0.095ng/mL。采用夹心酶联免疫吸附法测定血浆sICAM-1和sVCAM-1，其灵敏度分别为0.1 ng/mL和0.6 ng/mL,批内和批间误差分别在1.03%～2.82%，3.93%～8.15%(sICAM-1)和0.45%～2.27%，0.144%～5.94%(sVCAM-1)。
1.5.3 血脂检测 TC和TG采用酶法测定。即通过特殊氧化酶使底物生成过氧化氢，再通过氧化酶使它们结合成色原(生色团)，产生的颜色与分析物的量成正比，然后用比色法测定生色团的生成量。HDL-C采用磷钨沉淀法，磷钨酸-Mg2+可选择性沉淀LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)，上清液则为HDL。即在血清中分别加入MgCl2和磷钨酸液，充分混匀后离心，取上清液进行HDL-C测定。当浓度低于4.5 mmol/L时，VLDL中的胆固醇含量与血中TG浓度成完全线性关系。故可根据已知的HDL-C，TC和TG浓度计算出LDL-C浓度，即根据Friedewald公式[LDL-C(mmol/L)＝TC-HDL-C-TG/2.2]求得。
1.5.4 病理形态学观察 12周末处死动物，取其心脏和主动脉大体标本(从近主动脉弓部到腹腔干分支处)，生理盐水冲洗后沿正中线剪开，铺平，置于10%中性缓冲甲醛液中固定48 h，, 百拇医药(王建湘 程丑夫 韩育明)
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关键词：舒冠滴丸；动脉粥样硬化；细胞间黏附分子-1；细胞黏附分子-1：兔
中图分类号：R543.5 R285.6 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)10-0958-03
近年来，越来越多的证据表明炎症在不稳定动脉粥样硬化(AS)斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要的作用。CD40-CD40L作为重要的炎症信号通路，它的主要生物学效应之一是促进炎症介质如血管黏附分子的释放。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达增加可促进AS的慢性炎症过程，同时增加AS斑块的不稳定性，加快斑块裂隙，促进斑块破裂、血栓形成。因此，检测外周血可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性ICAM-1(sICAM-1)和可溶性VCAM-1(sVCAM-1)浓度可反映AS斑块的炎症程度和稳定性状况。舒冠滴丸是在古方心救汤(《石室秘录》)基础上，结合多年临床经验研制的防治冠心病心绞痛的有效验方，是以冰片、鹅不食草、三七、白芥子、肉桂、公丁香、红参等为主要组成部分，功能芳香通脉、益气温阳、豁痰化瘀。本研究通过构建兔动脉粥样硬化模型，观察舒冠滴丸对AS斑块CD40通路的调节作用，探讨其抗动脉粥样硬化的可能作用机制。
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1.1 实验动物 清洁级健康日本雄性大耳白兔44只，平均体重2.0 ks(1.9 ks～2.5kg)，由湖南中医药大学实验动物中心提供。医学实验动物合格证：医动字第20～003号。饲养条件：单笼分装，室温(25±2)℃，相对湿度65%±5%，实验前动物在实验饲养房内适应性喂养1周。实验环境设施合格证号：医动字第20-001号。
1.2 实验药物 舒冠滴丸每粒50 mg，由湖南中医药大学附一院药剂科提供，批号：20001030。舒降之片(辛伐他汀，每片20mg)，由默沙东制药有限公司提供，批号：20020530。
1.3 主要试剂、仪器 胆固醇粉(分析纯，每瓶25 g，荷兰进口上海试剂站分装)，猪油(市售)，蛋黄粉(陕西天斗蛋业有限公司提供)；sCD40L试剂盒(奥地利Bender MedSysterns公司提供)sICAM-1，sVCAM-1试剂盒(法国DIACLONE公司提供)，LD-A5型离心机(北京医用离心机厂生产)，CL-7200全自动生化分析仪(日本岛津公司)，721分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)，TP-1000电子天平(湘仪天平仪器厂生产)，DG-3022A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管制造厂制造)。
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1.4 兔动脉粥样硬化模型的建立及分组 将44只实验动物随机分成4组：空白组(8只)、模型组(12只)、舒冠滴丸组(12只)、辛伐他汀组(12只)。以上各组除空白组只给予标准全价营养饲料外，其余各组均每天每只给予高脂饲料100 g(含1.0 g胆固醇、7.5 g蛋黄粉、5.0 g猪油、86.5 g标准全价营养饲料)喂养8周，8周后随机抽取高脂饲料喂养兔2只处死，取胸主动脉标本制作病理切片以证实产生粥样硬化斑块。动脉粥样硬化模型造模成功后，舒冠滴丸组每只每日按人一兔等效量给药[50mg/(kg·d)]，辛伐他汀组每只每日喂服辛伐他汀药液[2.5mg/(kg·d)]，空白组、模型组灌饲蒸馏水10 mL，每组均给药4周，均于上午给食前灌胃。所有动物自由饮水，继续喂养4周。最终取得完整资料者进入分析，共28只，其中舒冠滴丸组7只。辛伐他汀组7只，模型组6只，空白对照组8只。
1.5 指标检测方法
1.5.1 标本处理 各组均于12周后分别从兔颈动脉收集血样(5～6)mL，注入10 mL肝素抗凝离心管，摇匀，3 500 r/min离心3 min，取上清血浆置于-70℃保存待测sCD40L，sICAM-1，sVCAM-1。同时测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
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1.5.2 血浆sCD40L，sICAM-1，sVCAM-1的检测 采用酶联免疫吸附法测定血浆sCD40L，其检测灵敏度为0.095ng/mL。采用夹心酶联免疫吸附法测定血浆sICAM-1和sVCAM-1，其灵敏度分别为0.1 ng/mL和0.6 ng/mL,批内和批间误差分别在1.03%～2.82%，3.93%～8.15%(sICAM-1)和0.45%～2.27%，0.144%～5.94%(sVCAM-1)。
1.5.3 血脂检测 TC和TG采用酶法测定。即通过特殊氧化酶使底物生成过氧化氢，再通过氧化酶使它们结合成色原(生色团)，产生的颜色与分析物的量成正比，然后用比色法测定生色团的生成量。HDL-C采用磷钨沉淀法，磷钨酸-Mg2+可选择性沉淀LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)，上清液则为HDL。即在血清中分别加入MgCl2和磷钨酸液，充分混匀后离心，取上清液进行HDL-C测定。当浓度低于4.5 mmol/L时，VLDL中的胆固醇含量与血中TG浓度成完全线性关系。故可根据已知的HDL-C，TC和TG浓度计算出LDL-C浓度，即根据Friedewald公式[LDL-C(mmol/L)＝TC-HDL-C-TG/2.2]求得。
1.5.4 病理形态学观察 12周末处死动物，取其心脏和主动脉大体标本(从近主动脉弓部到腹腔干分支处)，生理盐水冲洗后沿正中线剪开，铺平，置于10%中性缓冲甲醛液中固定48 h，, 百拇医药(王建湘 程丑夫 韩育明)