大鼠血管内皮祖细胞培养及鉴定
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朱江 刘煜敏 孔朝红 道文欣 武汉大学中南医院;
【摘要】目的探索骨髓来源的血管内皮祖细胞的分离培养方法,为缺血性疾病治疗找到新的移植细胞来源。方法采集SD雄性大鼠骨髓细胞,用梯度密度离心法分离单核个细胞,种植于提前包埋了纤维连接蛋白的培养皿中培养,将血管内皮生长因子(VEGF)、重组纤维细胞生长因子(bFGF)和重组上皮生长因子(EGF)作为诱导剂,将72h后贴壁细胞(A组)和非贴壁细胞(B组)分别培养,观察细胞形态的变化以及数量变化,取A组在第14天,应用免疫组化和免疫荧光技术鉴定内皮祖细胞系列标志。结果A组细胞经过体外诱导后大量扩增,在28d时仍有强大扩增的活力,呈铺路石样,而B组细胞短期内可以大量增殖,呈长索样,之后逐渐变少;在细胞迁移实验中,A组细胞可以相互融合形成血管结构,而B组细胞之间则不能融合,随着时间推移,逐渐凋亡;A组经过CD34免疫荧光、CD133、FLK-1免疫组化鉴定呈阳性,并能特异性吸附FITC-UEA-和内吞DIL-Ac-LDL。结论自体骨髓细胞通过贴壁换液后可以分离培养出内皮祖细胞,取贴壁细胞经过体外诱导后大量扩增,并通过表面标记物鉴定可以确认为内皮祖细胞,而非贴壁细胞不能大量增殖,故将贴壁分离方法来筛选内皮祖细胞,此方法简易,并能满足细胞移植的需要,因而,在移植治疗脑缺血引起的内皮损伤应该有较好的临床应用前景。
【关键词】 内皮祖细胞 骨髓 细胞培养
【基金】国家自然科学基金资助项目(No.30470601)
【分类号】R329.2
1997年Asahara等[1]报道内皮祖细胞分离成功,并在体内证明其血管生成的能力[1]。之后内皮祖细胞备受关注,研究者发现其在出生后血管生成的方式参与缺血部位的血管重建过程,在治疗肢体缺血、冠状动脉疾病、脑缺血以及糖尿病患者的血管形成能力都具有广阔的应用前景。然而,无论
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1997年Asahgra等报道内皮祖细胞分离成功，并在体内证明其血管生成的能力。之后内皮祖细胞备受关注，研究者发现其在出生后血管生成的方式参与缺血部位的血管重建过程，在治疗肢体缺血、冠状动脉疾病、脑缺血以及糖尿病患者的血管形成能力都具有广阔的应用前景。然而，无论骨髓、循环血液、脂肪组织及脐带血来源的内皮祖细胞的数量都有限，并且在分离EPC的方法上，采用免疫磁珠分选法用CD34磁珠、cDl33磁珠，虽然可以收集到的细胞纯度较高，但是单独培养时往往不能增殖，只有共同培养时才有增殖活性。并且免疫磁珠分选法存在操作复杂、费用较高的缺点，以往的取材多采用处死动物后分离骨髓细胞。本实验拟探讨大鼠在全麻的状态下取材，采用密度梯度离心法，通过贴壁换液的方法分离培养内皮祖细胞。
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