神经节苷脂联合参附注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用(2)
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2结果
2.1HE染色观察细胞假手术组海马组织结构基本正常，细胞排列整齐紧密，形态正常。高倍镜下可见神经元细胞核大而圆，透明，有1个~2个明显的核仁；缺血缺氧组：海马组织结构疏松，大脑皮层、海马细胞排列紊乱，且出现空泡、变性和坏死,正常神经元细胞减少；各干预组：各组大脑皮层、海马细胞变性、坏死明显减少。
2.2免疫组织化学结果
2.2.1Bcl-2表达Bcl-2阳性细胞广泛表达于大脑皮层和海马，为胞浆着色，染色呈棕黄色或黄褐色颗粒。假手术组中Bcl-2蛋白表达较弱，而HIBD组中Bcl-2表达增加，各治疗组中Bcl-2表达进一步增加，尤以合用组明显，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。2.2.2Bax的表达Bax阳性细胞主要位于细胞质，染色呈棕黄色颗粒。假手术组中有极少量Bax蛋白表达，HIBD组Bax表达增加，而各治疗组中Bax表达下降，尤以合用组明显，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。3讨论
脑缺氧缺血后神经元死亡是一种凋亡现象。动物实验已发现，缺氧缺血性脑损伤后早期就出现凋亡细胞，以皮层、海马、纹状体等部位为主，尤以24 h凋亡表达最明显[2]。细胞凋亡是涉及多基因调控的复杂主动死亡过程。Bcl-2家族是最主要的凋亡调控基因,在细胞凋亡途径的上游远端,构成一个重要的细胞内凋亡调控点[3-4]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一对调控因子,这两类分子的比例决定细胞是否发生凋亡。Bcl-2基因是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，也是迄今研究最广泛的凋亡调控基因之一。它可以通过多条途径抑制细胞凋亡，其主要机制可能有:抑制线粒体膜间隙中细胞色素的释放，从而阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应的激活[5]，抑制活性氧的产生[6],抑制钙离子内流等[7]。 而促凋亡蛋白(如Bax)则以非活性的形式分布于胞浆中或细胞骨架上，当细胞受到死亡信号刺激后，促凋亡蛋白发生构象变化，从胞浆中转位至线粒体外膜，并与膜上的抗凋亡蛋白发生相互作用，使抗凋亡蛋白丧失对细胞凋亡的抑制作用，引起线粒体内各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡[8,9]。
神经节苷脂(Gangliosides,Gg)是一种糖鞘脂,是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，在神经系统中尤为丰富。而单唾液酸四己糖神经节苷脂是哺乳类神经节苷脂的主要种类,它对神经元细胞的分化、生长、轴浆转运和再生起着重要作用[10]。GM1的分子结构是由一个疏水的神经酰胺部分和一个亲水的唾液酸寡糖基团组成。这种结构特征使其容易与细胞外的信息发生相互反应，影响细胞膜的活动而发挥其生物学功能。GM1作为重要的神经保护剂，新生大鼠脑缺血时外源性GM1可以透过血脑屏障，嵌入受损部位神经细胞膜，阻断兴奋性氨基酸神经毒性，调节细胞膜上Na-K+-ATP酶活性，减少脑组织内Ca2+浓度，发挥其抗细胞凋亡作用。张桂莲等[11]的实验证明GM1可使海马CA1区Bcl-2表达和Bcl-2 /Bax比值增高,从而发挥神经保护作用。
参附注射液已广泛应用于临床，在儿科临床也已有应用[12]。参附注射液主要成分为人参皂甙(Rb1)和乌头类生物碱,具有清除氧自由基、抗脂质过氧化、保护内皮细胞作用,保护修复心肌细胞的作用。其对HIE机制可能包括：能抗脂质过氧化反应和促进热休克蛋白(HSP70)表达 [13]。能清除海马椎体神经元产生的氧自由基,阻滞细胞膜上钙通道活动,减轻细胞内钙离子积聚,保护线粒体膜完整性,防止因Ca2+过度内流至线粒体膜的去极化,改善神经细胞能量代谢[14]。可抑制 NF-κB 活化及细胞间黏附分子TNF-α、 IL-10表达,从而起到脑保护作用。提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加内源性NO合成、减轻多形核白细胞(PMNs)黏附与聚集，对缺血再灌注损伤具有保护作用。乌头类生物碱作为β2受体激动剂,可增强缺氧心肌收缩力,改善心脏微循环[15],从而间接改善脑细胞能量代谢等。由此推测参附注射液是通过“多靶效应”起到上调HIE新生大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达及下调Bax蛋白表达,从而减少神经元凋亡。
本实验证实，新生大鼠缺氧缺血后，联合使用GM1及参附注射液对其脑损伤的改善效果较两药单独使用更为明显。推测其机制可能为：在新生大鼠脑缺氧缺血时，两者可以同时透过血脑屏障，同时发挥其神经保护作用，例如阻断兴奋性氨基酸神经毒性，减少脑组织内Ca2+浓度等抗细胞凋亡作用，共同起到上调保护性的基因调控蛋白Bcl-2及下调促凋亡蛋白Bax的表达。初步证明联合使用GM1及参附注射液对治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的疗效,确切改善效果及机制有待进一步探讨。
参考文献：
[1]Rice JE,Vannucci RC,Brierley JB.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J].Ann Neurol,1981:9(2):131-141.
[2]Cheng Y,Deshmukh MD,Costa A,et al ......
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