ERK在偏头痛动物模型中的激活及与肥大细胞脱颗粒间的关系(1)
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摘要：目的观察皮下注射硝酸甘油(GTN)诱导大鼠偏头痛模型中硬脑膜、三叉神经核尾部磷酸化ERK(p-ERK)的表达，及p-ERK表达与肥大细胞脱颗粒间的关系。方法24只雄性SD大鼠随机分为偏头痛模型组(n=18)和空白对照组(n=6)。模型组采用皮下注射GTN(10 mg/kg)法建立大鼠偏头痛模型，再将模型组大鼠随机分为3个亚组：C48/80组(腹腔注射C48/80，2 mg/kg)；SCG+ C48/80组(腹腔先注射SCG 10 mg/kg后再注射C48/80 2 mg/kg)和实验对照组(腹腔注射同等剂量的生理盐水)；空白对照组大鼠皮下注射等量生理盐水。模型组和空白对照组分别于15 min取硬脑膜和三叉神经核尾部。用免疫组织化学染色观察大鼠硬脑膜和三叉神经核尾部磷酸化ERK(p-ERK)的表达。结果ERK在模型组各亚组和空白对照组的硬脑膜和三叉神经核尾部都发生了磷酸化，但模型组各亚组p-ERK阳性免疫反应产物都明显高于空白对照组(P<0.05)，且C48/80组高于SCG+ C48/80组和实验对照组(P<0.05)。结论皮下注射GTN致大鼠偏头痛发作后，大鼠硬脑膜和三叉神经核尾部处p-ERK的表达增加，且随肥大细胞脱颗粒的多少而发生变化，提示ERK可能参与了偏头痛痛觉信号的传导，肥大细胞脱颗粒可能是促使p-ERK表达增加的原因，p-ERK在偏头痛的发病机制中发挥重要的作用。
关键词：偏头痛 细胞外信号调节激酶 肥大细胞 硬脑膜 三叉神经核尾部 硝酸甘油 大鼠
中图分类号：R747.2R255文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0587-03
偏头痛是一种反复发作的原发性脑功能障碍性疾病。WHO已将其列为世界范围内最容易影响日常生活和工作的疾病之一[1]，以及最容易致残的疾病之一,其致残性与四肢瘫痪相等同[2]。尽管偏头痛的发病率很高(我国患病率为0.99%，发达国家平均为12%)，但其真正的病理生理学机制至今仍不清楚，对于其治疗亦存在诸多不足，即便是急性发作的特异性治疗，亦难获满意疗效。故对偏头痛的确切发病机制及治疗研究有待进一步深入进行。
细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是目前疼痛研究进展中备受关注的信号转导通路。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK) 家族中的一员。在初级传入伤害感受神经元周围末梢中存在丝裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK的磷酸化形式(p-ERK)是这些伤害感受神经元兴奋的重要解剖学标志[3,4]。
肥大细胞脱颗粒能引起与其相邻的三叉神经脑膜伤害感受器持续激活，而这种激活是与p-ERK表达增加相伴随的[5]。本实验通过建立硝酸甘油(GTN)诱导的大鼠偏头痛模型，检测p-ERK的表达情况及p-ERK与肥大细胞脱颗粒间的关系，以探讨p-ERK在偏头痛发病过程中的病理生理作用，为偏头痛的治疗提供新的实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物及分组24只健康雄性SD(250 g～300 g)大鼠，随机分为模型组(n=18)和空白对照组(n=6)。模型组采用皮下注射GTN(10 mg/kg)法建立大鼠偏头痛模型，再将模型组随机分为3亚组，每组6只，C48/80组(腹腔注射肥大细胞脱颗粒剂Compound48/80，2 mg/kg)；SCG+ C48/80组(SCG,10 mg/kg后再注射C48/80，2 mg/kg)和实验对照组(腹腔注射生理盐水 2 mg/kg )，模型组各亚组分别注射C48/80、SCG+C48/80、生理盐水，15 min后取硬脑膜和三叉神经核尾部标本。空白对照组大鼠皮下注射等量生理盐水，15 min后取标本。
1.2偏头痛模型制备采用皮下注射GTN制作偏头痛模型[6],大鼠按10 mg/kg颈部皮下注射GTN(广州白云山明兴制药有限公司 批号:20090505)。5 min ～15 min大鼠出现双耳发红、后肢频繁挠头、爬笼次数增多等烦躁不安的现象,40 min～60 min达高峰。此现象可持续1 h～3 h,继之大鼠呈现蜷卧、活动减少状态。空白对照组大鼠皮下注射等剂量生理盐水。
1.3免疫组织化学将大鼠置于江湾Ⅰ型C立体定向仪上，取硬脑膜后取脑干(A系统定位于A 0.3 mm～5.7 mm,即耳间线后方0.3 mm～5.7 mm) [7]，将所取硬脑膜和组织块立即置于4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS固定4 h后，移入含30%的0.1 mol/L PBS液中过夜沉底(4 ℃)。连续冰冻切片，厚度为5 μm。DAB显色、酸性甲苯胺蓝复染、脱水、透明，中性树胶封片。阴性对照染色切片中用PBS代替一抗，其余步骤相同，结果均为阴性。
1.4图像分析采用MIAS-2000图像分析系统,目标平均灰度级(G0)、视场平均灰度级(Gv )和目标面积与视场面积比(AAR),测试仪器的最大灰度分级(Gmax)为255,应用免疫组织化学定量计算公式计算阳性单位(positive unit,PU):
PU=|G0-Gv|(1-AAR)×Gmax×100
1.5统计学处理采用SPSS 13.0统计软件分析。正态分布数据以均数±标准差(x±s)表示,多组数据比较用完全随机设计资料的方差分析、LSD-t检验。
2结果
2.1免疫组织化学染色在模型组各亚组和空白对照组的硬脑膜和三叉神经核尾部均可见p-ERK的阳性免疫反应产物，前者阳性免疫产物染色较深且主要分布于脱颗粒的肥大细胞附近，后者阳性细胞染色较淡。即模型组各亚组大鼠硬脑膜、三叉神经尾核均有p-ERK的阳性免疫反应产物增强，镜下观察以C48/80组最为显著。
2.2PU值检测结果ERK在模型组各亚组和空白对照组的硬脑膜和三叉神经核尾部都发生了磷酸化，但模型组各亚组p-ERK阳性免疫反应产物都明显高于空白对照组(P<0.05)，且C48/80组高于SCG+C48/80组和实验对照组(P<0 ......
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