高原环境下REM睡眠剥夺大鼠皮质GRP78的表达及药物干预(2)
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1.6凋亡细胞检测经北京中科通用医学图像分析系统(GMIAS2.0)处理，每只大鼠选取5张切片，每片随机取3个视野，以阳性染色细胞数进行统计分析。
1.7统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示，计数资料采用χ2检验，采用t检验、用方差分析。SPSS11.0软件分析。
2结果
2.1HE染色光镜下可见，兰州组正常睡眠组大鼠皮层细胞排列整齐，胞浆丰富，核呈圆形，居中。高可可西里组正常睡眠组大鼠皮层细胞排列稍紊乱，细胞轮廓稍模糊。SD组大鼠皮层区脑组织疏松淡然，结构排列紊乱，数目减少，体积变小，胞质浓缩，胞核固缩；GS Rd干预组神经元数目增多，细胞轮廓较清晰。
2.2免疫组织化学染色GRP78免疫反应阳性产物表现为棕黄色颗粒，分布于胞浆及胞核。兰州生理盐水对照组SD1 d后GRP78表达开始增多(P<0.05)，至SD3 d时达高峰(P<0.05)，至5 d与正常睡眠组无差别；GS Rd预先干预组SD1 d、3 d时GRP78表达均较生理盐水1 d、3 d组增高(P<0.05)；与兰州组比较，在各对应时间点可可西里组GRP78表达均高于兰州组(P<0.05)。详见表1、表2。
2.3TUNEL染色兰州组大鼠SD1 d、3 d皮质区可见凋亡细胞，核呈棕黄色颗粒；在SD5 d、GS Rd预先干预组及正常睡眠组均未见明显阳性细胞。SD后1 d、3 d皮质区细胞凋亡分别为(19.10±1.87、22.50±2.01)，SD1 d、3 d皮质区细胞凋亡数和正常睡眠组同区相比有统计学意义(P<0.05)，而SD5 d与正常睡眠组同区相比无统计学意义。可可西里组SD1 d、3 d皮质区细胞凋亡数分别为(21.16±3.12、24.35±3.01)，与兰州组比较，各时间点可可西里组凋亡细胞较兰州组明显(P<0.05)。
3讨论
GRP78位于内质网上，是内质网应激的特异性标志。当组织发生缺血、缺氧、细胞代谢紊乱时，导致GRP78大量表达，足量表达的GRP78，与细胞内未折叠或错误折叠的蛋白结合，通过恢复内质网功能，保证应激情况下蛋白合成，维持机体内环境稳定[4,5]。
SD可以引起内质网应激，长期SD可造成神经细胞内质网发生结构改变[6]，发生细胞凋亡，导致神经元的损伤。细胞凋亡是SD导致神经元损伤死亡的一种重要形式。通过某些药物干预细胞凋亡通路，可以使神经元细胞免受损伤，为此，选择中药GS Rd进行了实验性研究。
GS Rd是从中药人参、三七中提取的化合物，其通透性高，可以透过血脑屏障。GS Rd具有抗肿瘤[7]、抗变态反应[8]、抗骨质疏松[9]等多种生物学效应。本研究主要探讨GS Rd的神经保护作用。本实验选择2 mg/kg为给药剂量，每日给药1次，连续用药7 d，给药完毕后即进行SD。
本实验免疫组化结果显示，兰州组SD1d后大鼠的皮层区GRP78表达开始升高，提示SD引起细胞发生了内质网应激。随着SD时间的延长，GRP78表达逐渐增高，至第3天达高峰，此时未折叠蛋白反应能力最强，细胞由自身调节逐渐转向凋亡，TUNEL染色可见SD3 d 时凋亡细胞最多，也与免疫组化相一致。至SD5d GRP78的表达较正常睡眠组相比未见明显差异，可能与此时细胞内质网发生蛋白合成功能障碍有关。可可西里SD组GRP78的表达较兰州组增高，表明在缺氧、强辐射等高原暴露因素的参与下，加剧了内质网应激反应。药物GS Rd干预组大鼠GRP78的表达水平较生理盐水组增加，GS Rd可能是通过促进GRP78的表达来发挥保护内质网功能，减轻SD造成的脑损伤，可以为具有一定可预见性的脑损伤保护提供一个新的选择。
SD后神经细胞凋亡,涉及Ca2+超载、能量衰竭、自由基释放、线粒体损伤、兴奋性氨基酸毒性作用等。GS Rd是一种非特异性Ca2+通道阻断剂，能非选择性阻断受体依赖性Ca2+通道开放，抑制胞外Ca2+内流和胞浆Ca2+升高，抑制Na+-Ca2+交换，防止胞内Ca2+超载。另外GS Rd具有抗氧化损伤、抗辐射、调节免疫，扩张血管、改善微循环、促进血管内皮细胞功能恢复、调节血管活性物质等多种药理作用，也可能参与低氧及SD后脑损伤的保护作用。
参考文献:
[1]Daugaard M,Rohde M,Jaattela M,et al.The heat shock protein70 family:Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions[J].FEBS Lett,2007,581:3702-3710.
[2]Lamb HK,Mee C,Xu W,et al.The affinity of a major Ca2+ binding site on GRP78 is differentially enhanced by ADP and ATP[J].Biol Chem,2006,281:8796-8805 .
[3]Nouhi Z,Chevillard G,Derjuga A,et al ......
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