甘精\地特胰岛素对3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA表达的影响(1)
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摘要：目的 探讨不同浓度的人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素对体外3T3-L1脂肪细胞瘦素(leption)mRNA表达的影响。方法 通过不同浓度人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素刺激分化后的3T3-L1脂肪细胞,实时荧光定量PCR法测定瘦素mRNA表达。结果 随着人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素浓度的升高,瘦素mRNA表达逐渐升高,相同浓度的地特胰岛素、甘精胰岛素和人胰岛素对瘦素mRNA的促进作用有统计学意义(P<0.05)。结论 体外人胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素均可使分化后3T3-L1细胞瘦素表达增加；人胰岛素对3T3-L1细胞瘦素表达增加的作用最强，甘精胰岛素次之，地特胰岛素最弱。
关键词:人胰岛素；甘精胰岛素；地特胰岛素；瘦素；瘦素mRNA； 3T3-L1脂肪细胞
中图分类号：R587.1 R255.4 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)06-0717-03目前胰岛素类似物广泛应用于临床，为糖尿病患者带来方便，改善了患者的生活质量，减少了低血糖等严重并发症的发生，随着血糖的良好控制对远期并发症也将有良好的预防作用。但胰岛素类似物改变了人胰岛素的氨基酸组成和分子结构，而使得其发挥作用的时间、在人体内的代谢速度与人胰岛素有很大的区别，它对人体其他方面的作用还有待于将来大量的临床观察。本研究采用人胰岛素、胰岛素类似物(甘精胰岛素和地特胰岛素)分别处理分化后3T3-L1脂肪细胞，检测瘦素mRNA表达的变化，探讨胰岛素类似物与瘦素的相互关系。
1 材料与方法
1.1 主要实验用品及化学试剂 DMEM/F12(1∶1)培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物有限公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、三碘甲状腺原氨酸、人胰岛素、地塞米松均购自Sigma公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素由甘李药业有限公司提供；青霉素、链霉素购自华北制药股份有限公司；细胞培养板购自Corning公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；引物由上海生工生物工程技术服务公司合成；RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司；Fast Start Universal SYBR Green Master (ROX)购自Roche公司。
1.2 方法
1.2.1 3T3细胞-L1前脂肪细胞的分化 将3T3- L1前脂肪细胞接种于培养瓶中，在37 ℃、5% CO【sub】2【/sub】的条件下用含10% FBS的DMEM/F12培养液培养,48 h换液一次，待细胞融合生长后按1∶2传代，取同代对数生长期细胞，用含10%FBS的DMEM/12培养液配成单细胞悬液，细胞计数器计数，调整细胞密度为5×10【sup】4【/sup】/mL，接种于6孔培养板，每孔4 mL。CO【sub】2【/sub】孵箱培养24 h，待细胞达到80%汇合后开始换加分化培养基，其中含胰岛素0.25 μmol/L、甲状腺素0.2 nmol/L、地塞米松0.25 nmol/L、IBMX0.5 nmol/L，每48 h换液1次，每孔4 mL，换液2次之后，撤掉IBMX，用胰岛素、地塞米松、甲状腺素维持培养。
1.2.2 不同浓度甘精、地特、人胰岛素对脂肪细胞的瘦素mRNA表达的量效作用 3T3- L1前脂肪细胞分化第10天后改用DMEM/F12培养液培养24 h，消除诱导液的影响，分别加入含终浓度为1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的人、甘精和地特胰岛素，另设空白对照组。每组设3个复孔，继续培养24 h，提取细胞总RNA。
1.2.3 瘦素mRNA的检测 Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR仪进行逆转录构建cDNA模板，逆转录反应条件参照试剂盒说明。参照NCBI中的基因序列设计引物：目的基因Leptin(上游引物：5′- CTATGCCACCTTGGTCACCT- 3′，下游引物：5′- ACCAAACCAAGCATTTTTGC-3′ ，扩增片段长度：121bp),管家基因GAPDH(上游引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物：5′- TCCACCACCCTGTTGCTGGA- 3′，扩增片段长度：307 bp)。PCR反应体系:cDNA5.0 μL，Fast Start Universal SYBR Green Master (ROX)25.0 μL,上下游引物各0.5 μL,用DEPC -H【sub】2【/sub】O 补足至50 μL体积。实时荧光定量PCR仪扩增条件:瘦素95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,40个循环。以GADPH为管家基因，对照孔(无胰岛素刺激)为校正值，采用2-【sup】△△Ct【/sup】法计算基因表达的相对变化【sup】[1]【/sup】。△△Ct(Ct【sub】目的基因【/sub】-Ct【sub】管家基因【/sub】)待测样本-(Ct【sub】目的基因【/sub】-Ct【sub】管家基因【/sub】)样本校正，校正样本是任何被选做代表l倍目的基因表达量的样本。逆转录反应条件参照试剂盒说明。实验重复3 次,每组设3孔重复(N3,n3)。
1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行处理，所有数据以均数±标准差(x±s)表示,对各种浓度的4种胰岛素处理后瘦素mRNA的表达量的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验法。
2 结 果
2.1 不同浓度甘精、地特、人胰岛素对脂肪细胞的瘦素mRNA表达的量效作用 对照组(0 nmol/L)瘦素mRNA表达为1。瘦素mRNA表达随每种胰岛素质量浓度增高而升高，呈量效依赖性，与对照组相比，瘦素mRNA的表达差异有统计学意义,说明不同质量浓度不同胰岛素作用24 h均能促进分化后的3T3-L1脂肪细胞的瘦素mRNA表达。详见表1。
表1 相同胰岛素不同浓度对3T3-L1脂肪
细胞瘦素mRNA表达的影响( x±s)
2.2 相同浓度的不同胰岛素对脂肪细胞的瘦素mRNA表达 1 nmol/L人、甘精、地特胰岛素刺激分化成熟的3T3-L1脂肪细胞瘦素mRNA表达分别为5 ......
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