大鼠预缺氧模型的制备
 |
| 第1页 |
参见附件(2037KB，3页)。
摘要:目的 制备简单易行的大鼠预缺氧模型，并观察其对脑组织低氧诱导因子-1(HIF-1)α蛋白及mRNA表达的影响。方法 雄性SD大鼠12只，随机分为缺氧组和对照组。缺氧组在固定体积的容器中缓慢输入混合气体，调节氧气和氮气的流入速度，使测氧仪监测到的O【sub】2【/sub】浓度始终保持在12%，然后放入大鼠，每天4 h；对照组大鼠在相同容器中通入空气，每天4 h。7 d后进行免疫组化和RT-PCR测定脑组织HIF-1α蛋白及mRNA表达。结果 缺氧组较对照组脑组织中HIF-1α蛋白和mRNA表达增多(P<0.01)。结论 此模型简单易行，达到预缺氧的要求。
关键词：预缺氧模型；脑组织；低氧诱导因子-1
中图分类号：R743 R255.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)06-0719-021990年Kitagawa等【sup】[1]【/sup】在沙土鼠脑缺血的实验研究中发现缺血预处理有神经保护作用,Arboix等【sup】[2]【/sup】发现，发生过短暂性脑缺血发作(TIA)的脑梗死患者预后较好，提出TIA可能增加脑缺血的耐受性；Yi-Wei Tsai等【sup】[3]【/sup】的研究，采用电凝局灶性脑梗死大鼠模型，发现造模7 d后间断缺氧能明显减少梗死体积；使得预缺血缺氧的研究成为热点。低氧诱导因子-1(HIF-1)是一种氧敏感转录激活因子，在哺乳动物的各种组织细胞中广泛表达，有利于促进机体和细胞对低氧环境的适应。本研究拟对一种简单易行大鼠预缺氧模型进行探讨，并进行大鼠脑组织HIF-1免疫组化和RT-PCR测定，判断此模型的可靠性。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 健康雄性SD大鼠12只，体重280 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。随机分为缺氧组和对照组。
1.2 主要试剂和设备 缺氧设备组成：密闭容器、氧气罐、氮气罐、测氧仪；兔抗大鼠HIF-1α单克隆抗体、ABC试剂盒购自博奥森，引物由北京全式金生物技术有限公司合成。
1.3 预缺氧模型制备 在固定体积的容器中缓慢输入氧气、氮气，使测氧仪监测到的O【sub】2【/sub】浓度始终保持在12%，然后放入大鼠。并保持温度、湿度恒定。在缺氧环境下的大鼠出现呼吸频率加快,自发性活动减少。缺氧组大鼠每天缺氧4 h，连续7 d。对照组大鼠在相同容器中通入空气，每天4 h，连续7 d。
1.4 免疫组化 用石蜡切片机自前囟后3 mm处开始向后行冠状位切片，层厚1.5 μm，梯度乙醇脱蜡至水,3%H【sub】2【/sub】O【sub】2【/sub】室温孵育20 min,高压锅热修复2 min,加冰迅速冷却，非相关蛋白封闭15 min,分别滴加一抗(兔抗大鼠HIF-1α抗体,浓度为1∶200)，4 ℃过夜,生物素化二抗室温孵育15 min，辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液室温孵育15 min，DAB显色，适时终止，苏木素复染核，脱水、透明、封片。光学显微镜下观察大鼠海马和大脑皮层的神经细胞，以细胞内出现鲜艳的棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片高倍镜(10×40倍)下随机选择5个不同的视野,计数每个视野中阳性细胞数,取其平均值，检测皮层区HIF-1α的表达。
1.5 RT-PCR检测HIF-1αmRNA 取脑组织在1% DEPC水中稍作漂洗后立即放入细胞冻存管中，并存放于-80 ℃冰箱。按TRIZOL法提取组织中HIF-1α总 mRNA，所提总RNA经紫外分光光度计测样品RNA含量和纯度。HIF-1α引物，上游:tcaagtcagcaacgtggaag，下游:tatcgaggctgtgtcgactg，扩增产物为198bp；Gapdh 引物，上游:tgaacgggaagctcactgg，下游:tccaccaccctgttgctgga，扩增产物为307bp。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，35 个循环，反应结束后，反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。用Bio-Rad 图像分析系统软件进行光密度分析。HIF-1α的相对表达量用HIF-1α扩增产物的光密度值/GAPDH 扩增产物的光密度值×100% 表示。
1.6 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准差(x±s)表示,两组比较采用t检验。
2 结 果
2.1 免疫组化 光学显微镜下观察大鼠海马和大脑皮层的神经细胞，以细胞内出现鲜艳的棕黄色颗粒为阳性细胞。对照组大鼠有少量HIF -1α蛋白表达,主要分布于皮层的锥体细胞，胞浆、胞核均有明显着色。缺氧组HIF -1α阳性神经元的表达明显增多,散在分布,主要分布于皮层、海马、纹状体。缺氧组HIF -1α蛋白表达为22.88±2.09，高于对照组的12.85±1.79(P<0.01)。
2.2 脑组织HIF-1αmRNA的水平 HIF-1α与内参照GAPDH mRNA比较得相对转录水平，结果显示：对照组HIF-1αmRNA较弱，为0.150 8±0.017 8，缺氧组明显上升，为0.607 9±0.040 1，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
3 讨 论
HIF-1是一种氧敏感转录激活因子，由氧调节亚单位HIF-1α和结构亚单位HIF-1β组成的异二聚体，在机体耐受缺氧、维持体内氧稳态方面发挥重要作用。在缺氧预处理过程中HIF-1α作为转录因子与胞核中HIF-1β相互作用，启动低氧易感靶基因，从而使HIF靶基因血管内皮生长因子、促红细胞生成素(EPO)、iNOS、葡萄糖转运体-1(GLUT-1)、血红素氧化酶等基因表达上调，保护24 h后再缺血的损伤。正常氧分压时脑组织表达很少，氧浓度降低时可诱导HIF-1快速、大量的表达。
现国内外【sup】[3]【/sup】普遍采用混合灌装气体进行缺氧，氧氮混合气体灌装技术有难度，依靠实验室自身难以完成，另外氧气的浓度不好把握。本研究采用氧气和氮气分装，可以随实验条件自由调节氧的浓度，且设施简单，容易操作。
本研究在固定体积的容器中缓慢输入氧气、氮气，使测氧仪监测到的O【sub】2【/sub】 浓度始终保持在12%，然后放入大鼠。并保持温度、湿度恒定。在缺氧环境下的大鼠出现呼吸频率加快,自发性活动减少。缺氧组大鼠每天间断缺氧4 h后，连续7 d。对照组大鼠在相同容器中逗留7 d(通入空气，每天4 h)。通过免疫组化和RT-PCR测定脑组织HIF-1α蛋白及mRNA表达 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2037KB，3页)。