RNA干扰靶向XIAP对人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为影响(1)
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参见附件(3396KB，7页)。
摘要:目的 采用RNA干扰技术(RNAi)抑制X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)，观察抑制前后人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为。方法 DNA重组技术合成针对人脑胶质瘤U251细胞XIAP基因三条siRNA(siRNA1，siRNA2，siRNA3)，以脂质体2000作为载体进行转染，RT-PCR法检测XIAP的mRNA表达，选择特异性较高的siRNA，以此 siRNA为标准建立20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L3个浓度梯度，转染细胞，Western blot 检测XIAP基因的蛋白表达，选出最低有效浓度；流式细胞仪检测抑制前后细胞周期和凋亡率。结果 siRNA成功转染了人脑胶质瘤细胞U251，转染率达到80%以上；RT-PCR检测siRNA2特异性较高；Western-blot检测终浓度为30 nmol/L的siRNA抑制效率较高；流式细胞仪检测停滞在G0/G1期的细胞增多，在S期的细胞减少，并且细胞的凋亡率增加。结论 通过RNA干扰可以抑制人脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达，促进人脑胶质瘤细胞凋亡，从而抑制细胞的生长。
关键词：RNA干扰；脑胶质瘤细胞U251；X连锁凋亡抑制蛋白
中图分类号：R739.4 R255.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2011)06-0720-03脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性疾病，起源于神经上皮的原发肿瘤，约占颅内肿瘤的35%～60%，具有血供丰富，浸润性生长等恶性肿瘤的生物学特点。外科手术要完全切除脑胶质瘤很难，化学治疗、放疗的治疗效果不容乐观，且易发生一些毒副反应，肿瘤复发率高，预后差，病死率高。近几年来，在临床上对脑胶质瘤的综合治疗措施不断的改进和提高，但其死亡率仍未下降，其中位生存期仅13个月。脑胶质瘤的恶性进展及其复发是一个涉及多基因、多阶段、多步骤的复杂过程，现阶段脑胶质瘤基因治疗表现出了它的优越性，X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP) 是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor apoptosis proteins，IAPs)中的成分之一，且是IAPs中抗凋亡作用最强的，研究显示XIAP在多种正常细胞中呈现低表达状态，但在恶性肿瘤中表达则呈高表达状态【sup】[1]【/sup】 。IAPs编码一组结构相关的蛋白质，它的主要功能是抑制细胞凋亡，在凋亡调控中发挥着关键作用，从现在的研究发现IAPs有八个主要成员，研究比较多的是其中的XIAP和survivin。目前，国内外尚未见以XIAP为靶点治疗脑胶质瘤的类似报道。本实验选择RNA干扰技术，设计特异性针对XIAP的siRNA，将siRNA转染人脑胶质瘤细胞U251细胞，检测XIAP的表达及其细胞周期和凋亡率的改变。为临床诊断和治疗脑胶质瘤奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 脑胶质瘤细胞(山西医科大学)， RNA提取试剂盒(北京飞捷生物公司)，lipofectamin 2000(Invitrogen 公司)，RT-PCR一步法试剂盒(Promega公司)，DNAmark(Takara公司)，Protein Markers(Hong KongTech.Co.Ltd)，β-actin小鼠单抗(晶美生物公司)，辣根过氧化酶标记山羊IgG(H+L)(中杉金桥公司)，XIAP(3F3)小鼠单抗(sc58470)(Santa Cruz Biotechnology.Inc)，SiRNA1-3(北京三博远志生物技术有限责任公司)。
1.2 方法
1.2.1 脑胶质瘤细U2451细胞siRNA转染效率检测 在37 ℃，5% CO【sub】2【/sub】温箱以10%的RPM1640培养液培养人脑胶质瘤U251细胞，胰酶消化传代。当细胞达到对数期以 2×10【sup】5【/sup】的密度接种6孔板，24 h后用带荧光的siRNA转染细胞，在转染前1 h用无血清无抗生素的空白1640换液2次，细胞呈饥饿状态。按照锐博公司siRNA转染说明将配好的siRNA和脂质体2000在室温下混合20 min，逐滴加入6孔板，在37 ℃，5% CO【sub】2【/sub】温箱孵育24 h后观察其转染效率。转染效率(发出绿色荧光的细胞数/总细胞数)×100%。
1.2.2 实验分组 根据实验需要分为5组：筛选有效siRNA后，将有效siRNA按浓度分为20 nmol/L组、30 nmol/L组、50 nmol/L组，并且有阴性对照组和阳性对照组。
1.2.3 RT-PCR检测特异性的siRNA 登陆NCBI网站，从GeneBank上查询XIAP的mRNA序列，根据XIAP的mRNA序列，用Primer5软件设计RT-PCR引物，并用BLAST比对，内参为GAPDH，参照GeneBank资料设计。取对数生长期细胞，用20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L浓度siRNA转染后培养24 h为实验组，正常培养未加干预细胞为对照组，提取RNA步骤按照RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒进行。建立50 μL的反应体系，将无核酸酶水，AMV/Tfi 5×反应缓冲液，dNTP混合物，特异上下游引物及25 mmol/L MgSO【sub】4【/sub】加入倒置于冰上的0.5 mL薄壁反应管中，配制成反应混合物。然后向反应体系中加入AMV反转录酶和Tfi DNA聚合酶。将反应管轻柔振荡10 s以使该混合物混匀。反应条件如下48 ℃ 45 min， 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s ......
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