益气养阴活血方对病毒性扩张型心肌病小鼠TNF(1)
摘要:目的 观察益气养阴、活血化瘀方对病毒性扩张型心肌病小鼠心肌组织肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)mRNA的影响，并从分子生物学水平探讨其作用机制。方法 采用Balb/c小鼠多次腹腔注射柯萨奇B3m病毒方式，建立重复感染早期病毒性扩张型心肌病动物模型。210只Balb/c小鼠，随机分为4组，空白组30只，模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，各60只。运用病理学及RT
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PCR法，观察益气养阴、活血化瘀方对病毒性扩张型心肌病小鼠心脏质量指数、病理形态学、超微结构以及心肌组织TNF
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α mRNA表达的影响。结果 益气养阴、活血化瘀方能下调病毒性扩张型心肌病小鼠心肌组织TNF
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α mRNA的表达，以高剂量组效果为佳。结论 益气养阴、活血化瘀方可下调病毒性扩张型小鼠心肌组织TNF
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α的表达，抑制小鼠自身免疫反应，从而对病毒性扩张型心肌病起到一定的防治作用。
关键词：益气养阴;活血化瘀；病毒性扩张型心肌病；肿瘤坏死因子
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α
中图分类号：R542.2 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672
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1349(2011)09
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1086
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02
本研究根据慢性心肌炎及早期扩张型心肌病(DCM)患者之气阴两虚、瘀血阻滞、热毒残留的症候特点。观察益气养阴活血方对小鼠心肌组织病理形态学变化及心肌组织肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)的影响，初步揭示作用机制，为中医药早期治疗DCM提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 210只雄性Balb/c小鼠，体重10 g，3周～4周龄，由北京军事医学科学院实验动物中心提供。分笼饲养，每笼10只室温(26±3)℃，均食用普通饲料。
1.2 病毒 柯萨奇B3m (CVB3m)病毒(Nancy株，购自哈尔滨医科大学克山病研究所)，在Hela细胞中传代，冻融3次，离心(2 000 r/min，10 min)，上清液分装，在Hela细胞中测50%组织感染率(TCID50)为10-7，-70 ℃保存备用。
1.3 实验用药 益气养阴活血组方：黄芪、红参、生地、麦冬、五味子、川芎、丹参、兰根、大青叶、桔梗、升麻、远志、柏子仁、合欢皮。中药经水提取，制成浸膏，含水量为21%。用蒸馏水稀释，调整浓度为82%，即相当于每毫升悬液中含生药4.3 g备用。黑龙江中医药大学制剂室提供。生产日期：20051108。
1.4 主要试剂 试剂盒TrizolRNAIsolation、反转录试剂盒由美国Invitrogen公司提供、TaqDNA聚合酶由大连宝生物有限公司提供。PCR Marker试剂盒由美国Promega公司提供。PCR引物,应用引物设计软件Primer5.0设计引物，上海捷倍思基因有限公司合成。详见表1。
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1) 为黑龙江自然基金青年专项基金课题(No.QC06C069)
表1 PCR引物序列
1.5 模型制备及分组 3周～4周龄雄性Balb/c小鼠共210只，自然光线，自由饮水，自由摄食条件下适应性喂养1周。1周后，其中180只Balb/c小鼠随机分为4组：正常对照组、模型组，中药高、低剂量组。正常对照组30只，模型组，中药高、低剂量组各60只。中药高剂量组、中药低剂量组、模型对照组均于实验的1 d、8 d、15 d、22 d、36 d、50 d分别予腹腔注射RM1640液稀释的0.1 mL10-4 TCID50CVB3m、0.1 mL 10-3 TCID50CVB3m、0.2 mL10-3 TCID50CVB3m、0.1 mL10-3 TCID50CVB3m、0.1 mL10-4 TCID50CVB3m、0.1 mL10-4 TCID50CVB3m。正常对照组分别于实验同期注射同体积的RM1640液。
1.6 给药方法 各组均于末次病毒注射后10 d，即实验的第60天开始灌胃。中药低、高剂量组均给予益气养阴活血方混悬液灌胃，剂量分别为10.35 g/(kg·d)及20.7 g/(kg·d)，以上给药剂量均为生药量。模型对照组和正常对照组灌以同体积蒸馏水。每日1次灌胃，连续4周。
1.7 取材 称重后将小鼠用颈椎脱臼的方式处死，置入盛70%乙醇的烧杯中，使其体毛完全润湿。小鼠置于70%乙醇润湿纸巾，剪开将腹部皮肤，无菌取出心脏，将血液拭干，称重后取1/2投入液氮罐中，-70 ℃低温冰箱保存，备反转录
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聚合酶链反应RT
PCR)mRNA检测。
1.8 检测指标及方法 RT
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PCR法检测心肌组织肿瘤坏死因子mRNA表达。
1.9 统计学处理 应用SPSS11.0 软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组均数间比较用方差分析，两两比较用q检验。等级资料组间比较应用秩和检验。样本率比较用χ2检验。
2 结 果
2.1 小鼠心肌组织TNF
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α mRNA电泳条带比较 TNF
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α mRNA在琼脂糖电泳凝胶上紫外灯下观察均可见653 bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。各组β
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actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为432bp。
2.2 小鼠心肌组织TNF
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α mRNA电泳产物灰度扫描值变化(见表2) 与正常组相比，模型组、中药组小鼠TNF
________________________________________, http://www.100md.com(安静 陈会君)
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α(TNF
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α)mRNA的影响，并从分子生物学水平探讨其作用机制。方法 采用Balb/c小鼠多次腹腔注射柯萨奇B3m病毒方式，建立重复感染早期病毒性扩张型心肌病动物模型。210只Balb/c小鼠，随机分为4组，空白组30只，模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，各60只。运用病理学及RT
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PCR法，观察益气养阴、活血化瘀方对病毒性扩张型心肌病小鼠心脏质量指数、病理形态学、超微结构以及心肌组织TNF
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α mRNA表达的影响。结果 益气养阴、活血化瘀方能下调病毒性扩张型心肌病小鼠心肌组织TNF
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α mRNA的表达，以高剂量组效果为佳。结论 益气养阴、活血化瘀方可下调病毒性扩张型小鼠心肌组织TNF
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α的表达，抑制小鼠自身免疫反应，从而对病毒性扩张型心肌病起到一定的防治作用。
关键词：益气养阴;活血化瘀；病毒性扩张型心肌病；肿瘤坏死因子
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α
中图分类号：R542.2 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672
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1349(2011)09
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02
本研究根据慢性心肌炎及早期扩张型心肌病(DCM)患者之气阴两虚、瘀血阻滞、热毒残留的症候特点。观察益气养阴活血方对小鼠心肌组织病理形态学变化及心肌组织肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)的影响，初步揭示作用机制，为中医药早期治疗DCM提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 210只雄性Balb/c小鼠，体重10 g，3周～4周龄，由北京军事医学科学院实验动物中心提供。分笼饲养，每笼10只室温(26±3)℃，均食用普通饲料。
1.2 病毒 柯萨奇B3m (CVB3m)病毒(Nancy株，购自哈尔滨医科大学克山病研究所)，在Hela细胞中传代，冻融3次，离心(2 000 r/min，10 min)，上清液分装，在Hela细胞中测50%组织感染率(TCID50)为10-7，-70 ℃保存备用。
1.3 实验用药 益气养阴活血组方：黄芪、红参、生地、麦冬、五味子、川芎、丹参、兰根、大青叶、桔梗、升麻、远志、柏子仁、合欢皮。中药经水提取，制成浸膏，含水量为21%。用蒸馏水稀释，调整浓度为82%，即相当于每毫升悬液中含生药4.3 g备用。黑龙江中医药大学制剂室提供。生产日期：20051108。
1.4 主要试剂 试剂盒TrizolRNAIsolation、反转录试剂盒由美国Invitrogen公司提供、TaqDNA聚合酶由大连宝生物有限公司提供。PCR Marker试剂盒由美国Promega公司提供。PCR引物,应用引物设计软件Primer5.0设计引物，上海捷倍思基因有限公司合成。详见表1。
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1) 为黑龙江自然基金青年专项基金课题(No.QC06C069)
表1 PCR引物序列
1.5 模型制备及分组 3周～4周龄雄性Balb/c小鼠共210只，自然光线，自由饮水，自由摄食条件下适应性喂养1周。1周后，其中180只Balb/c小鼠随机分为4组：正常对照组、模型组，中药高、低剂量组。正常对照组30只，模型组，中药高、低剂量组各60只。中药高剂量组、中药低剂量组、模型对照组均于实验的1 d、8 d、15 d、22 d、36 d、50 d分别予腹腔注射RM1640液稀释的0.1 mL10-4 TCID50CVB3m、0.1 mL 10-3 TCID50CVB3m、0.2 mL10-3 TCID50CVB3m、0.1 mL10-3 TCID50CVB3m、0.1 mL10-4 TCID50CVB3m、0.1 mL10-4 TCID50CVB3m。正常对照组分别于实验同期注射同体积的RM1640液。
1.6 给药方法 各组均于末次病毒注射后10 d，即实验的第60天开始灌胃。中药低、高剂量组均给予益气养阴活血方混悬液灌胃，剂量分别为10.35 g/(kg·d)及20.7 g/(kg·d)，以上给药剂量均为生药量。模型对照组和正常对照组灌以同体积蒸馏水。每日1次灌胃，连续4周。
1.7 取材 称重后将小鼠用颈椎脱臼的方式处死，置入盛70%乙醇的烧杯中，使其体毛完全润湿。小鼠置于70%乙醇润湿纸巾，剪开将腹部皮肤，无菌取出心脏，将血液拭干，称重后取1/2投入液氮罐中，-70 ℃低温冰箱保存，备反转录
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聚合酶链反应RT
PCR)mRNA检测。
1.8 检测指标及方法 RT
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PCR法检测心肌组织肿瘤坏死因子mRNA表达。
1.9 统计学处理 应用SPSS11.0 软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组均数间比较用方差分析，两两比较用q检验。等级资料组间比较应用秩和检验。样本率比较用χ2检验。
2 结 果
2.1 小鼠心肌组织TNF
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α mRNA电泳条带比较 TNF
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α mRNA在琼脂糖电泳凝胶上紫外灯下观察均可见653 bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。各组β
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actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为432bp。
2.2 小鼠心肌组织TNF
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α mRNA电泳产物灰度扫描值变化(见表2) 与正常组相比，模型组、中药组小鼠TNF
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