清热化瘀方对脑缺血再灌注大鼠GDNFmRNA及其蛋白表达的影响1)
摘要：目的观察大鼠脑缺血再灌注后脑内胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) mRNA和蛋白的表达变化以及清热化瘀方对其的影响。方法 采用线栓法制作局灶性脑缺血大鼠(MCAO)模型，用原位杂交法和免疫组化法观察脑缺血后 3 h、6 h、12 h及 1 d、3 d、7 d共 6个时间点 GDNF mRNA及其蛋白的表达变化。结果 缺血半暗带GDNF mRNA及其蛋白的表达均于缺血灌注后3 h开始明显上升，6 h达高峰，12 h表达开始减弱(P<0.05或P<0.01)，3 d后降至正常水平。清热化瘀方治疗后可以上调GDNF的表达。结论 清热化瘀方可促进脑缺血后GDNF的表达，保护神经元。
关键词:清热化瘀方；脑缺血；胶质细胞源性神经营养因子
中图分类号：R743.31 R255.2 文献标识码：A 文章编号：1672
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, http://www.100md.com
1349(2011)09
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1088
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02
Effect of Qingre Huayu Prescription on Expression of Glial Cell Line
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derived Neurotrophic Fator
, 百拇医药
mRNA and Protein in Rats after Cerebral Ischemia/reperfusion
Hu Yueqiang，Tang Nong，Liu Tai，et al
The First Affiliated Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine(Nanning 530023)
Abstract:Objective To observe the mRNA and protein levels of glial cell line
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derived neurotrophic fator(GDNF) in rats after focal cerebral ischemia/reperfusion(I/R) and effect of Qingre Huayu prescription(QHP) on them.Methods The I/R rat models were established by middle cerebral artery occlusion to observe the expression variation of GDNF mRNA and protein at 3 h，6 h，12 h and 1 d，4 d，7 d after I/R by in situ hybridization and immunochemistry method.ResultsThe expression of GDNF mRNA and protein in the penumbra region were increased at 3 h after reperfusion，and peaked at 6 hours，then decreased continuously at 12 h(P<0.05 or P<0.01).The level of GDNF was increased in QHP group.Conclusion Qingre Huayu prescription could protect neuron through upregulating the expression of GDNF after I/R in rats.
, http://www.100md.com
Key words: Qingre Huayu prescription；cerebral ischemia；glial cell line
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derived neurotrophic fator
脑缺血损伤后，除了存在一种主动性的程序性细胞死亡(凋亡)过程，在耐受细胞内还存在一种平行的主动性神经元存活过程，而神经营养因子就参与了这种主动性神经元存活过程。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是转化生长因子超家族成员，是一个最有效的营养因子[1]，对多种神经元具有营养作用。它有促进多巴胺能神经元的存活，促进神经元轴突的定向生长以及促进运动神经元损伤修复和神经再生等作用。本实验通过研究清热化瘀方对脑缺血后GDNF mRNA及其蛋白表达的影响，以探讨脑缺血后GDNF的表达变化规律及清热化瘀方治疗脑缺血的脑保护作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物分组及处理 SD大鼠96只，雌雄各半，体重250 g±20 g，随机分为正常对照组(A组)、假手术组(B组)、模型组(C组)和清热化瘀组(D组)，后3组按处死时间分为术后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d 6个时间点，每个时间点5只动物。正常组大鼠不处理；假手术组线栓只插入颈内动脉9 mm，使大脑中动脉起始部不致阻塞；模型组造模后灌胃等体积的生理盐水；清热化瘀组动物造模后，以清热化瘀汤(由水牛角、丹参、赤芍、地龙、石菖蒲等10味中药组成)14 g/(kg·d)灌胃。各组均在术前6 h灌胃一次，且6 h、12 h、24 h、3 d、7 d时间点的动物在手术后清醒时开始灌胃，每天上、下午各一次，每次1.4 mL/100 g大鼠，其浓度及等效剂量按体表面积折算。
1.2 动物模型制作 参考Longa的线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血模型。试验过程和动物苏醒期间，保持动物的体温正常。
, http://www.100md.com
1.3 组织处理 将大鼠常规麻醉后，经左心室先后用生理盐水和4%的多聚甲醛进行灌注。然后取脑组织固定、脱水、石蜡包埋，按4 μm厚度连续切片。
1.4 缺血半暗带脑皮质GDNF mRNA表达测定 原位杂交法，按试剂盒说明进行操作。
1.5 缺血半暗带脑皮质GDNF蛋白表达测定 免疫组化法。切片以1%H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加正常山羊血清封闭液室温下孵育30 min，接着分别滴加1∶100稀释的小鼠抗大鼠GDNF单克隆抗体(Santa Cruz,USA)，4℃过夜，然后以PBS洗涤。再滴加1∶100的二抗生物素化兔IgG(武汉博士德)，PBS冲洗，切片以ABC试剂盒,按厂家说明进行处理。
1.6 结果观察 在生物光学显微镜下观察脑缺血周围区的GDNF的阳性神经元，采用HPIAS
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1000彩色病理图像分析系统进行分析，测定原位杂交和免疫组化阳性细胞染色的光密度(OD)值。每张切片测定4个视野(×400)，取平均值作为测定值。, http://www.100md.com(胡跃强 唐农 刘泰 刘尊敬 祝美珍 胡玉英 范立雷)
关键词:清热化瘀方；脑缺血；胶质细胞源性神经营养因子
中图分类号：R743.31 R255.2 文献标识码：A 文章编号：1672
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1349(2011)09
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Effect of Qingre Huayu Prescription on Expression of Glial Cell Line
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derived Neurotrophic Fator
, 百拇医药
mRNA and Protein in Rats after Cerebral Ischemia/reperfusion
Hu Yueqiang，Tang Nong，Liu Tai，et al
The First Affiliated Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine(Nanning 530023)
Abstract:Objective To observe the mRNA and protein levels of glial cell line
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derived neurotrophic fator(GDNF) in rats after focal cerebral ischemia/reperfusion(I/R) and effect of Qingre Huayu prescription(QHP) on them.Methods The I/R rat models were established by middle cerebral artery occlusion to observe the expression variation of GDNF mRNA and protein at 3 h，6 h，12 h and 1 d，4 d，7 d after I/R by in situ hybridization and immunochemistry method.ResultsThe expression of GDNF mRNA and protein in the penumbra region were increased at 3 h after reperfusion，and peaked at 6 hours，then decreased continuously at 12 h(P<0.05 or P<0.01).The level of GDNF was increased in QHP group.Conclusion Qingre Huayu prescription could protect neuron through upregulating the expression of GDNF after I/R in rats.
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Key words: Qingre Huayu prescription；cerebral ischemia；glial cell line
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derived neurotrophic fator
脑缺血损伤后，除了存在一种主动性的程序性细胞死亡(凋亡)过程，在耐受细胞内还存在一种平行的主动性神经元存活过程，而神经营养因子就参与了这种主动性神经元存活过程。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是转化生长因子超家族成员，是一个最有效的营养因子[1]，对多种神经元具有营养作用。它有促进多巴胺能神经元的存活，促进神经元轴突的定向生长以及促进运动神经元损伤修复和神经再生等作用。本实验通过研究清热化瘀方对脑缺血后GDNF mRNA及其蛋白表达的影响，以探讨脑缺血后GDNF的表达变化规律及清热化瘀方治疗脑缺血的脑保护作用机制。
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1 材料与方法
1.1 动物分组及处理 SD大鼠96只，雌雄各半，体重250 g±20 g，随机分为正常对照组(A组)、假手术组(B组)、模型组(C组)和清热化瘀组(D组)，后3组按处死时间分为术后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d 6个时间点，每个时间点5只动物。正常组大鼠不处理；假手术组线栓只插入颈内动脉9 mm，使大脑中动脉起始部不致阻塞；模型组造模后灌胃等体积的生理盐水；清热化瘀组动物造模后，以清热化瘀汤(由水牛角、丹参、赤芍、地龙、石菖蒲等10味中药组成)14 g/(kg·d)灌胃。各组均在术前6 h灌胃一次，且6 h、12 h、24 h、3 d、7 d时间点的动物在手术后清醒时开始灌胃，每天上、下午各一次，每次1.4 mL/100 g大鼠，其浓度及等效剂量按体表面积折算。
1.2 动物模型制作 参考Longa的线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血模型。试验过程和动物苏醒期间，保持动物的体温正常。
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1.3 组织处理 将大鼠常规麻醉后，经左心室先后用生理盐水和4%的多聚甲醛进行灌注。然后取脑组织固定、脱水、石蜡包埋，按4 μm厚度连续切片。
1.4 缺血半暗带脑皮质GDNF mRNA表达测定 原位杂交法，按试剂盒说明进行操作。
1.5 缺血半暗带脑皮质GDNF蛋白表达测定 免疫组化法。切片以1%H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加正常山羊血清封闭液室温下孵育30 min，接着分别滴加1∶100稀释的小鼠抗大鼠GDNF单克隆抗体(Santa Cruz,USA)，4℃过夜，然后以PBS洗涤。再滴加1∶100的二抗生物素化兔IgG(武汉博士德)，PBS冲洗，切片以ABC试剂盒,按厂家说明进行处理。
1.6 结果观察 在生物光学显微镜下观察脑缺血周围区的GDNF的阳性神经元，采用HPIAS
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1000彩色病理图像分析系统进行分析，测定原位杂交和免疫组化阳性细胞染色的光密度(OD)值。每张切片测定4个视野(×400)，取平均值作为测定值。, http://www.100md.com(胡跃强 唐农 刘泰 刘尊敬 祝美珍 胡玉英 范立雷)