绞股蓝皂甙对Aβ诱导AD细胞模型的影响(3)
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注：Ⅰ代表空白对照组；Ⅱ代表BDNF组；Ⅲ代表SLs组；Ⅳ代表Aβ140组；Ⅴ代表Aβ140+BDNF组；Ⅵ代表Aβ140+SLs组。
图2 各处理组ChAT免疫反应阳性神经元数
2.4 SLs预处理对Aβ140诱导神经元的iNOS表达的影响 空白对照组、BDNF组、SLs组、Aβ140组、Aβ140+BDNF组和Aβ140+SLs组iNOS免疫染色阳性细胞数分别为41.00±2.92、40.00±2.89、40.00±2.96、67.00±5.26、46.00±2.78、45.00±2.97。与空白对照组比较，Aβ140组iNOS免疫细胞化学染色阳性细胞数目明显增多(P<0.05)；与Aβ140组比较，Aβ140+SLs组和Aβ140+BDNF组iNOS免疫阳性细胞数减少(P<0.05)，说明SLs预处理可有效抑制Aβ140诱导神经元的iNOS表达的增加。详见图3。
注：Ⅰ代表空白对照组；Ⅱ代表BDNF组；Ⅲ代表SLs组；Ⅳ代表Aβ140组；Ⅴ代表Aβ140+BDNF组；Ⅵ代表Aβ140+SLs组。
图3 SLs对Aβ140诱导的iNOS表达的抑制作用
2.5 SLs预处理对细胞凋亡的影响 在流式细胞仪测定中，Annexin V/PI双染色分出凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞，空白对照组、BDNF组、SLs组、Aβ140组、Aβ140+BDNF组和Aβ140+SLs组细胞凋亡5次检测结果相近，6组细胞凋亡数分别为30.00±2.31、29.00±2.12、28.00±2.49、57.00±3.83、33.00±1.75、34.00±3.46。与空白对照组比较,Aβ140组细胞凋亡数增高(P<0.05)；与Aβ140组比较, SLs+Aβ140组和Aβ140+BDNF组细胞凋亡数降低(P<0.05)，说明SLs预处理对Aβ140诱导的细胞凋亡具有明显抑制作用。详见图4。
注：Ⅰ代表空白对照组；Ⅱ代表BDNF组；Ⅲ代表SLs组；Ⅳ代表Aβ140组；Ⅴ代表Aβ140+BDNF组；Ⅵ代表Aβ140+SLs组。
3 讨 论
基底前脑聚集着神经系统约30%胆碱能神经元，又是海马胆碱能传入纤维的起源。基底前脑胆碱能神经元丢失与海马结构内胆碱能传入神经支配的损害是学习记忆减退原因之一。因此，多数学者认为脑内胆碱能系统的损害是造成AD主要可能机制，从而提出了“胆碱能假说”[6]。Aβ是AD脑内老年斑的主要结构物质，Aβ的毒性作用是AD发病机制中的中心环节。Aβ诱导的AD大鼠模型已广泛应用于AD实验研究。本实验取胚鼠基底前脑原代培养神经细胞，采用大鼠Aβ140诱导胆碱能神经元损伤，在体外建立AD细胞模型[7]；培养环境相对稳定,可控性很强，有利于排除非处理因素对结果的影响。
BDNF是在脑内合成的一种蛋白质，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。BDNF 分子单体是由119 个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9199，分子量为1 315 kD ，主要由β折叠和无规N级结构组成。分析表明BDNF 的氨基酸序列有相当一部分与神经生长因子(nerve growth factor，NGF) 相同，故通称为神经营养因子(neurotrophic factor，NTF)，常用于作为神经元保护作用研究的阳性对照药物。绞股蓝皂甙来源于葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Mak.的全草。属绞股蓝总皂甙的共约有80余种，其中78种分别命名为绞股蓝皂甙Ⅰ~LXXVⅢ，其中有一部分分别为人参皂甙Rb1、Rb3、Rd，以及人参二醇、2α羟基人参二醇，2α，19二羟基12脱氧人参二醇等。其成分的含量测定和成品标准，也都以人参皂甙Rb1的多少作为标准。
本实验结果提示，Aβ140+SLs组细胞活性与ChAT阳性细胞数均高于Aβ140组(P<0.05)，Aβ140+SLs组iNOS阳性细胞数与细胞凋亡数均低于Aβ140组(P<0.05)。即SLs可促进体外培养的胆碱能神经元及其突起生长，可提高神经元的活性和ChAT表达；并可有效抑制Aβ140诱导的神经元iNOS表达和细胞凋亡。我们认为，SLs可能是通过对抗Aβ氧化损伤等途径来发挥作用。一方面，SLs对抗Aβ引起的细胞膜损伤，保护细胞膜完整性，降低Ca2+的通透性，减少Ca2+内流和细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的大量产生，从而抑制细胞损伤、凋亡或死亡[5]。另一方面，SLs对抗Aβ引起的线粒体膜稳态及完整性的破坏，恢复线粒体电子传递链和三羧酸循环中的关键酶的活性，改善线粒体功能、抑制细胞凋亡[8]。SLs也可能是通过影响Bax/bcl2、细胞色素C、caspase3等细胞凋亡相关因子活性来抑制细胞凋亡[9]。
本实验研究证明绞股蓝皂甙对Aβ诱导的胚鼠基底前脑胆碱能神经元损伤有明显的拮抗作用，即绞股蓝皂甙对Aβ诱导的AD细胞模型具有保护作用；进而为防治AD提供了一种新的活性物质。但多数研究表明[10,11]，绞股蓝皂甙防治AD的作用可能是多靶点、多环节的结果，其详细的作用机制尚待进一步的实验研究。
参考文献：
[1] Wang X,Blanchard J,Kohlbrenner E,et al.The carboxyterminal fragment of inhibitor2 of protein phosphatase2A induces Alzheimer disease pathology and cognitive impairment[J].FASEB J，2010，22：11521253.
[2] Xu ZQ,Li J,Deng J,et al.Effects of proBDNF on cell proliferation and differentiation in hippocampal dentate gyrus in Alzheimer’s disease rat model[J].Natl Med J China,2010,90(19):13531356.
[3] Megalli S,Davies NM,Roufogalis BD.Antihyperlipidemic and hypoglycemic effects of Gynostemma pentaphyllum in the Zucker fatty rat[J].Pharm Pharm Sci,2006,9(3):281291 ......
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