张卓伟，柳 洁，张华屏

    糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死的主要原因之一，而内皮细胞的损伤是血管病变的前提。同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)作为心血管疾病的危险因素，与糖尿病血管并发症的发生、发展有一定关系。但其具体发病机制尚未阐明。研究显示可能与高血压、血流流变学、血脂紊乱、高血糖等因素有关，而有关蛋白质、氨基酸代谢异常在糖尿病血管并发症中作用的研究非常匮乏[1]。因此本研究观察HCY对体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)ECV-304活性氧的释放和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达的影响，为临床早期干预高同型半胱氨酸血症提供新的理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株购自南京凯基生物合成有限公司；RPMI1640购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。D-L同型半胱氨酸、胰蛋白酶为Sigma公司产品；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。PCR试剂盒购于大连宝生物公司，引物由上海生物公司合成。其他试剂均为国产分析纯或进口分装。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养和实验分组 人血管内皮细胞株用RPMI1640培养，用前加10%灭活胎牛血清。细胞置于5%的CO2培养箱中37℃孵育培养，0.25%的胰酶消化传代。分组情况，正常对照组：含RPMI1640培养液。高糖组(HG组)：培养液中含终浓度25mmol/L葡萄糖。HCY组：培养液中含终浓度5 mmol/L HCY。高糖+HCY组：培养液中含葡萄糖25mmol/L和 HCY 5mmol/L。

    1.2.2 倒置显微镜观察细胞生长状态

    1.2.2.1 上清液收集及检测 ECV-304以每孔1×106接种到6孔板上，当生长至85%融合时收集上清液。按上述实验分组方法，在作用12h、24h、48h之后分别收集细胞培养上清液，离心以去除细胞碎片，-20℃保存备用，用硫代巴比妥酸法检测MDA，黄嘌呤氧化酶法检测SOD。

    1.2.2.2 RT-PCR检测ICAM-1mRNA的表达水平 将ECV-304细胞接种于培养瓶中，随机分组和处理同上。处理12 h、24h、48h后分别收集各组细胞，Trizol法提取RNA，琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度仪检测260nm、280nm吸光度并求出A260/A280，结果是所提RNA值在1.8～2.0，说明纯度符合要求。进行cDNA合成，反转录后的cDNA作为PCR模板 ......