吕 茹，裴 硕，樊芳芳，张 潍，冉博文，胡晓芸

    研究表明，吸烟可造成血管内皮损伤，促进血小板的聚集与黏附，是动静脉血栓形成的独立危险因素[1]。组织纤溶酶原激活剂(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是纤溶系统的一对重要的调节因子，主要由血管内皮细胞产生和分泌。尼古丁为香烟烟雾的主要有害物质之一，本课题组前期实验证实，尼古丁通过打破内皮细胞t-PA/PAI-1的动态平衡，增加血栓形成的风险[2]。蛋白激酶-α(PKC-α)是细胞内重要的生物信息转导通路，属PKC亚型中的钙离子依赖型或经典型。PKC激活是血管内皮功能紊乱的关键环节之一[3]，但不同刺激物诱导内皮细胞PAI-1活化其信号转导通路不尽相同，PKC-α信号通路是否在尼古丁诱导的内皮细胞纤溶功能紊乱中发挥作用有待证实。本研究通过尼古丁及PKC抑制剂Staurosporine(STS)处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，观察各组细胞PAI-1的表达变化及伴随的PKC-α通道蛋白的变化，探讨吸烟引起内皮细胞纤溶紊乱的可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料与主要试剂 HUVECs细胞株购自上海门堞塔生物科技发展有限公司，为ATCC来源细胞株。尼古丁、STS均购自美国Sigma公司。RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司。PAI-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海太阳生物技术公司。聚合酶链式反应法(PCR)引物、内参照GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成。Trizol RNA提取试剂盒、实时荧光聚合酶链式反应法(RT-PCR)试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。β-actin抗体、小鼠PKC-α单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗均购自美国Santa Cruz公司。荧光FITC标记的羊抗小鼠IgG单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

    1.2 HUVECs的培养与分组 用10%FBS的RPMI-1640培养液 ......