程序冷冻法冷冻精子进行IVF—ET的临床结局分析(1)
[摘要]目的：探讨程序冷冻法冷冻精子在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的临床结局及安全性。方法：回顾分析在本中心进行IVF-ET治疗的不孕夫妇的372个周期，分为4个组：用程序冷冻法冷冻精子行常规IVF共76个周期(A组)，程序冷冻法冷冻精子行ICSI共92个周期(B组)，同期新鲜精液行常规IVF周期97例(C组)，新鲜精液行ICSI周期107例(D组)，分别比较A组与C组、B组与D组的正常受精率、异常受精率、卵裂率、优质胚胎率、妊娠率、种植率、流产率、多胎率和畸形率。结果：与新鲜精液IVF-ET组相比较，程序冷冻法冷冻精子常规IVF组及ICSI组的正常受精率、异常受精率、卵裂率、妊娠率、种植率、流产率、多胎率和畸形率等方面差异无统计学意义(P>0.05)：但冷冻精子行ICSI组与新鲜精子行ICSI比较，优质胚胎率低且有统计学意义(P<0.05)。结论：用程序冷冻法冷冻精子助孕可以获得与新鲜精子相似的结局，是一种较为安全可靠的精液保存方法，可用于IVF—ET术前精液冷冻保存。
[关键词]程序冷冻法；精子冷冻；体外受精-胚胎移植
[中图分类号]11697 [文献标志码]A
精子冷冻作为一种常规技术应用于不孕症的治疗当中。精液的预先冷冻可以减少取精困难的患者取卵日当天的取精压力，为取卵日当天因为特殊原因无法来医院取精的男性患者提供方便，同时也可以保存患者在经皮副睾穿刺取精(PESA)或睾丸穿刺取精(TESA)手术中获得的精子，亦可以对有需要的患者(接触毒物、放射性及癌症放化疗等)进行生育率保存。如何提高精子冷冻技术水平、减少精子冷冻损伤与保持冷冻精子的正常功能是我们在工作中值得关注的问题。而程序冷冻法是目前精子冷冻中较为常用的方法之一。本文回顾性分析了2009年1月至2013年10月在本中心进行体外受精一胚胎移植(IVF-ET)的372个周期，探讨程序冷冻法冷冻精子对IVF和ICSI临床效果和安全性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象与分组
随机选取2009年1月至2013年10月在我院生殖中心进行不孕症治疗的患者共计372个周期，排除夫妇双方染色体异常、女方卵巢反应不良、子宫内膜异位症。根据是否冷冻和受精方式不同分为四组：用程序化冷冻法冷冻的夫精行常规1VF治疗76个周期(A组)；用程序化冷冻法冷冻的夫精行ICSI治疗的共92个周期(B组)；同期用鲜精常规行IVF-ET的97个周期(C组)；用鲜精常规行ICSI的107个周期(D组)。ICSI指证是：(1)严重少、弱、畸形精子症；(2)既往体外受精-胚胎移植周期(IVF-ET)受精率低(<30%)；(3)精子顶体反应异常。患者在我中心进行精子冷冻保存并签订知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 精液冷冻 男方清洁双手后，手淫取精，将精液留取于无菌容器内。精液液化后用梯度离心法300g×15min离心，吸取离心管底部精子沉淀，加入3mL ART-1006精子洗涤液(Quinn s，美国)，200g×10min离心洗涤2次，留取精子沉淀0.2mL，缓慢添加精子冷冻液ART-8020(SAGE，美国)1：1，边滴边搅拌，将充分混匀的精子分装入麦管中，放入程序冷冻仪CL-8800(CRYOLOGIC，澳大利亚)中运行冷冻程序，完成冷冻后放入液氮中冷冻保存。
1.2.2 精液解冻 采用快速复温法，从液氮罐中取出装有冷冻精液的麦管，直接放入37℃水中复温10min，加入3mL ART-1006精子洗涤液(Quinn s，美国)，200g×10min离心洗涤2次，体外获能2h后，行常规IVF或ICSI。
1.2.3 促排卯方案及卵子收集 选择有助孕指征的患者，根据患者的情况选择常规的长方案、短方案或为微刺激方案超排卵，当主导卵泡≥18mm或2个主导卵泡≥17mm时，当晚肌注hCG(丽珠)10000IU后36h在B超下经阴道取卵，在体视显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合物(COCs)，于5%SPS的拣卵液反复冲洗后，放入含10%SPS的受精液中37℃、5%C02和95%空气的培养箱中培养4～6h后备用。
1.2.4 受精方法 根据男方精液情况选择行常规IVF或ICSI。常规IVF：取卵后将卵子放入培养液中培养4～6h，按每个卵子10万条的比例加入洗涤好备用的精子进行体外受精。ICSI：取卵后将卵子放入培养液中培养4～6h，选取MⅡ期卵子注射之前准备好的精子。
1.2.5 受精、卵裂、胚胎观察和妊娠诊断 受精后16～20 h后观察卵子受精情况，取卵后第2d或第5d进行胚胎观察与移植，移植胚胎数不超过3个。移植2周后，检验血hCG了解是否妊娠，第35d行超声检查，见到孕囊并有心管搏动为临床妊娠。
1.2.6 统计学分析 应用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采用两个独立样本t检验分析，率的比较采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本研究对268个周期的程序法冷冻精子进行了回顾性分析，比较了程序法冷冻的精子与新鲜精子行常规IVF及ICSI的临床效果，结果显示各组患者年龄、不孕年限、获卵数、移植胚胎数均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
与新鲜精子IVF组相比较，冷冻精子IVF组的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、种植率、流产率、多胎率、畸形率等方面差异无统计学意义(P>0.05)，但冷冻精子IVF组受精率低于新鲜精子IVF组且有统计学意义(P<0.05)。见表2。
冷冻精子ICSI组受精率、正常受精率、卵裂率、临床妊娠率、种植率、流产率、多胎率、畸形率等方面与新鲜精子ICSI组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但优质胚胎率低于新鲜精子ICSI组且有统计学意义，(P<0.05)。见表3。 (杨铭 王勇 段金良)
[关键词]程序冷冻法；精子冷冻；体外受精-胚胎移植
[中图分类号]11697 [文献标志码]A
精子冷冻作为一种常规技术应用于不孕症的治疗当中。精液的预先冷冻可以减少取精困难的患者取卵日当天的取精压力，为取卵日当天因为特殊原因无法来医院取精的男性患者提供方便，同时也可以保存患者在经皮副睾穿刺取精(PESA)或睾丸穿刺取精(TESA)手术中获得的精子，亦可以对有需要的患者(接触毒物、放射性及癌症放化疗等)进行生育率保存。如何提高精子冷冻技术水平、减少精子冷冻损伤与保持冷冻精子的正常功能是我们在工作中值得关注的问题。而程序冷冻法是目前精子冷冻中较为常用的方法之一。本文回顾性分析了2009年1月至2013年10月在本中心进行体外受精一胚胎移植(IVF-ET)的372个周期，探讨程序冷冻法冷冻精子对IVF和ICSI临床效果和安全性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象与分组
随机选取2009年1月至2013年10月在我院生殖中心进行不孕症治疗的患者共计372个周期，排除夫妇双方染色体异常、女方卵巢反应不良、子宫内膜异位症。根据是否冷冻和受精方式不同分为四组：用程序化冷冻法冷冻的夫精行常规1VF治疗76个周期(A组)；用程序化冷冻法冷冻的夫精行ICSI治疗的共92个周期(B组)；同期用鲜精常规行IVF-ET的97个周期(C组)；用鲜精常规行ICSI的107个周期(D组)。ICSI指证是：(1)严重少、弱、畸形精子症；(2)既往体外受精-胚胎移植周期(IVF-ET)受精率低(<30%)；(3)精子顶体反应异常。患者在我中心进行精子冷冻保存并签订知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 精液冷冻 男方清洁双手后，手淫取精，将精液留取于无菌容器内。精液液化后用梯度离心法300g×15min离心，吸取离心管底部精子沉淀，加入3mL ART-1006精子洗涤液(Quinn s，美国)，200g×10min离心洗涤2次，留取精子沉淀0.2mL，缓慢添加精子冷冻液ART-8020(SAGE，美国)1：1，边滴边搅拌，将充分混匀的精子分装入麦管中，放入程序冷冻仪CL-8800(CRYOLOGIC，澳大利亚)中运行冷冻程序，完成冷冻后放入液氮中冷冻保存。
1.2.2 精液解冻 采用快速复温法，从液氮罐中取出装有冷冻精液的麦管，直接放入37℃水中复温10min，加入3mL ART-1006精子洗涤液(Quinn s，美国)，200g×10min离心洗涤2次，体外获能2h后，行常规IVF或ICSI。
1.2.3 促排卯方案及卵子收集 选择有助孕指征的患者，根据患者的情况选择常规的长方案、短方案或为微刺激方案超排卵，当主导卵泡≥18mm或2个主导卵泡≥17mm时，当晚肌注hCG(丽珠)10000IU后36h在B超下经阴道取卵，在体视显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合物(COCs)，于5%SPS的拣卵液反复冲洗后，放入含10%SPS的受精液中37℃、5%C02和95%空气的培养箱中培养4～6h后备用。
1.2.4 受精方法 根据男方精液情况选择行常规IVF或ICSI。常规IVF：取卵后将卵子放入培养液中培养4～6h，按每个卵子10万条的比例加入洗涤好备用的精子进行体外受精。ICSI：取卵后将卵子放入培养液中培养4～6h，选取MⅡ期卵子注射之前准备好的精子。
1.2.5 受精、卵裂、胚胎观察和妊娠诊断 受精后16～20 h后观察卵子受精情况，取卵后第2d或第5d进行胚胎观察与移植，移植胚胎数不超过3个。移植2周后，检验血hCG了解是否妊娠，第35d行超声检查，见到孕囊并有心管搏动为临床妊娠。
1.2.6 统计学分析 应用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采用两个独立样本t检验分析，率的比较采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本研究对268个周期的程序法冷冻精子进行了回顾性分析，比较了程序法冷冻的精子与新鲜精子行常规IVF及ICSI的临床效果，结果显示各组患者年龄、不孕年限、获卵数、移植胚胎数均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
与新鲜精子IVF组相比较，冷冻精子IVF组的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、种植率、流产率、多胎率、畸形率等方面差异无统计学意义(P>0.05)，但冷冻精子IVF组受精率低于新鲜精子IVF组且有统计学意义(P<0.05)。见表2。
冷冻精子ICSI组受精率、正常受精率、卵裂率、临床妊娠率、种植率、流产率、多胎率、畸形率等方面与新鲜精子ICSI组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但优质胚胎率低于新鲜精子ICSI组且有统计学意义，(P<0.05)。见表3。 (杨铭 王勇 段金良)